Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 075-15-2023-610 (внутренний номер 13.2251.21.0225) о предоставлении субсидии от 30 августа 2023 г. по теме: «Создание платформы для скрининга гербицидов на основе генетически кодируемой биолюминесценции», по мероприятиям 2.1-2.2.
За отчетный период 2-го этапа (01.01.2024 – 31.12.2024) в рамках выполнения соглашения № 075-15-2023-610 (внутренний номер 13.2251.21.0225) о предоставлении субсидии от 30 августа 2023 г. по теме: «Создание платформы для скрининга гербицидов на основе генетически кодируемой биолюминесценции» были проведены следующие работы:
- Получение стабильной линии трансгенного табака, конститутивно экспрессирующей выбранную компактную биолюминесцентную систему грибов.
- Проведение исследований влияния известных гербицидов на люминесценцию, испускаемую полученными трансгенными растениями.
В результате выполнения работ второго этапа работ по Соглашению № 075-15-2023-610 о предоставлении субсидии получены следующие основные результаты:
- В ходе реализации проекта получены линии трансгенных растений Nicotiana benthamiana, стабильно экспрессирующих компактную биолюминесцентную систему с конститутивной экспрессией.
- Для получения трансгенных растений должен был использован метод агробактериальной трансформации.
- Проведена трансформация Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 генетической конструкцией, несущей конститутивно экспрессируемую компактную биолюминесцентную систему.
- Наличие плазмиды, несущей конститутивно экспрессируемую компактную биолюминесцентную систему, подтверждено методом полимеразной цепной реакции.
- Проведена трансформация N. benthamiana путем обработки листовых эксплантов суспензией агробактерий с последующей регенерацией и отбором на антибиотике (канамицине или гигромицине, в зависимости от используемого селективного маркера).
- Проведен отбор трансформантов методом генотипированием – проведением полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, соответствующих последовательностям генов биолюминесцентной системы, и по их способности светиться.
- Осуществлена регистрация люминесценции трансформантов с помощью фотокамер – специализированного оборудования – IVIS Spectrum CT, Fusion-Pulse.7 или TECAN Spark Imager, или фотокамер – Sony Alpha ILCE-7m3 или Nikon D800.
- Определены и использованы подходящие параметры для съемки: выдержка, ISO в зависимости от яркости получаемых образцов.
- Проведена статистическая обработка изображений в Fiji и с использованием собственного программного обеспечения, написанного на языке программирования python и разработанного в организации-грантополучателе.
- Яркость растений, конститутивно экспрессирующих компактную биолюминесцентную систему, не уступала яркости растений, стабильно экспрессирующих исходную биолюминесцентную систему более, чем на порядок, при измерении с помощью Fusion-Pulse.7 или фотокамеры Sony Alpha ILCE-7m3.
- Проведено исследование влияния известных гербицидов на люминесценцию, испускаемую полученными трансгенными растениями.
- Яркость растений, конститутивно экспрессирующих компактную биолюминесцентную систему составляла не менее 0.5 миллиарда фотонов/мин.
- В качестве внешнего стимула использован ряд выбранных веществ, влияющих на метаболизм растений – гербициды или фитогормоны.
- Разработана программа и методики исследовательских испытаний трансгенных растений, конститутивно экспрессирующих компактную биолюминесцентную систему, в реализации специализированного ответа (изменение люминесценции) под действием известных гербицидов.
- Проведена обработка известными гербицидами линии трансгенных растений Nicotiana benthamiana, стабильно экспрессирующих компактную биолюминесцентную систему с конститутивной экспрессией, высаженных в почву.
- Использована технология люминесцентного имиджинга для скрининга различных гербицидов в почве в диапазоне концентраций, разработанная иностранной организацией.
- Отобран ряд известных гербицидов, используемых в сельском хозяйстве, на основе данных литературы.
- Подобраны концентрации исследуемых гербицидов исходя из данных литературы.
- Регистрация люминесценции растений была осуществлена с помощью фотокамер – Sony Alpha ILCE-7m3 или Nikon D800.
- В зависимости от яркости получаемых образцов определены и использованы подходящие параметры для съемки: выдержка, ISO.
- Все проведенные эксперименты были выполнены в объеме минимум трех биологических и трех технических повторов, согласно экспериментальным методикам с использованием специализированного оборудования.
- Статистическая обработка изображений была проведена в Fiji и с использованием собственного программного обеспечения, написанного на языке программирования python и разработанного в организации-грантополучателе.
- Полученные растения должны значимо отвечали на обработку гербицидами в сравнении с контролями (без обработки) как в случае повышения интенсивности свечения, так и его понижения.
- По результатам проведенных испытаний были получены экспериментальные образцы растений-биосенсоров с оптимальными свойствами.
- Проведено обобщение результатов проекта, проведена оценка результативности исследований и эффективности результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
Все задачи второго этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исследований Соглашения № 075-15-2023-610 (внутренний номер 13.2251.21.0225) о предоставлении субсидии от 30 августа 2023 г.
28 декабря