Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 075-15-2024-653 (внутренний номер 13.2251.21.0257) о предоставлении субсидии от 28 августа 2024 г. по теме: «Систематическая характеризация промоторов и терминаторов для экспрессии генов в клетках однодольных растений», по мероприятиям 1.1-1.3.
За отчетный период 1-го этапа (28.08.2024 – 31.12.2024) в рамках выполнения соглашения № 075-15-2024-653 (внутренний номер 13.2251.21.0257) о предоставлении субсидии от 28 августа 2024 г. по теме: «Систематическая характеризация промоторов и терминаторов для экспрессии генов в клетках однодольных растений» были проведены следующие работы:
- Отбор генетических элементов – промоторов и терминаторов – для экспрессии генов в клетках однодольных растений.
- Настройка метода визуализации люминесценции в растениях в лаборатории партнера в Эфиопии, с помощью российской команды.
- Отработка технологии временной экспрессии плазмид, несущих репортерный ген, в отобранных линиях клеток однодольных растений.
В результате выполнения работ первого этапа работ по Соглашению № 075-15-2024-653 о предоставлении субсидии получены следующие основные результаты:
- Выполнен аналитический обзор литературы по отбору генетических элементов (промоторов и терминаторов) для решения задач проекта.
- Проведен обзор промоторов и терминаторов, которые ранее были протестированы в однодольных растениях.
- Проведен обзор методов временной трансформации однодольных видов растений.
- На основании аналитического обзора был проведен выбор направления исследований и предложены оптимальные подходы для решения научных задач проекта.
- «Сила» промоторов и терминаторов была оценена по флуоресценции репортерного гена, испускаемой экспрессирующими этот ген клетками.
- Набор регуляторных элементов включали природные растительные, природные вирусные, а также синтетические промоторы и терминаторы.
- Протестированы две области 5’UTR в промоторах – TMV omega из вируса табачной мозаики и 5’UTR гена RbcS2B (AT5g38420, A. thaliana).
- Протестирован ряд конститутивных промоторов.
- Протестирован ряд терминаторов.
- Была подготовлена установка для визуализации люминесценции в растениях в лаборатории партнера в Эфиопии с помощью российской команды и подготовлено оборудование.
- Была проведена закупка оборудования (фотокамеры Sony alpha ILCE-7m3 и объектив Samyang AF 35mm f/1.4 Sony FE II или Nikon D800 и объектив Sigma AF 35-mmf/1.4 DG HSM Art) для получения изображений люминесцентных растений.
- Была оборудована темная комната для проведения люминесцентного имиджинга растений и растительных клеток с поддерживаемым для оптимального роста растений освещением – для растений, растущих in vitro, были использованы следующие условия: 12–16-ч фотопериод, со смешанным холодным белым и красным светом (люминесцентные лампы Cool White и Gro-Lux); для растений в горшках – в условиях 12 ч света и 12 ч темноты.
- Интенсивность света составляла 40 μmol s−1, m−2.
- Поддерживалась температура 24±1°C и 75% относительной влажности в помещении для съемки.
- Режим съемки включал использование ISO от 400 до 20000 со времени экспозиции от 5 с до 30 с.
- Была отработана технология временной экспрессии плазмид, несущих репортерный ген, в отобранных линиях клеток однодольных растений.
- Была использована плазмида, пригодная для трансформации однодольных видов растений с учетом следующего:
- Все регуляторные элементы располагались на одной плазмиде.
- Были использованы векторы, поддерживающие синтаксис клонирования технологии MoClo.
- Плазмиды содержали ориджин репликации в бактериях, кассету устойчивости к антибиотику ампициллину в бактериях и агробактериях для отбора трансформантов.
- Плазмиды предусматривали наличие участков T-DNA для интеграции генов интереса в геном растений.
- Для отработки технологии была использована плазмида, несущая транскрипционную единицу p35S_0.4kb–5′UTR TMV omega - Promoter 35s (Cauliflower Mosaic Virus), 0.4 kb in combination with 5′UTR, omega (Tobacco Mosaic Virus) – GFP – tOCS - 3′UTR + terminator OCS (A. tumefaciens).
- Проведена оценена функциональности полученных плазмид, кодирующих транскрипционные единицы под контролем различных комбинаций промоторов и терминаторов, с учетом следующего:
- Проведена валидация созданных плазмид путем временной экспрессии в клетках растений и регистрации испускаемой ими флуоресценции.
- Осуществлен выбор оптимального штамма агробактерий для трансформации клеток однодольных растений.
- Один из исследуемых штаммов агробактерий стал штамм AGL0.
- Полученными плазмидами были трансформированы агробактерии Agrobacterium tumefaciens выбранных штаммов согласно методике, описанной в работе (Liu et al., 2023; doi: 10.3390/life13112217).
- Успешность трансформаций агробактерий была подтверждена полимеразной цепной реакцией на ген GFP.
- Оптическая плотность суспензии агробактерий, которая была нанесена на клетки для проведения временной экспрессии, была одинаковой для всех исследуемых плазмид.
- Отработана методика ко-экспрессии р19 (анти-сайленсера) и гена GFP в клетках однодольных культур.
- Определен оптимальный состав среды для выращивания отобранных суспензионных культур: наличие и концентрация солей Мурашиге-Скуга, витаминов, тиамина, фитогормонов.
- Протестирован разный возраст культуры клеток однодольных растений для проведения временной экспрессии генов.
- Временные трансформации клеток суспензионных культур были проведены в формате 96-луночных планшетов.
- За основу протокола для временной трансформации клеток был взят протокол, описанный в (Gengenbach, Opdensteinen, and Buyel 2020; doi: 10.3389/fbioe.2020.00393).
- Клетки 7-дневных суспензий были осаждены в 96-луночные планшеты с перфорированным дном для получения полусухого осадка.
- Осадки клеток были обработаны суспензией агробактерий.
- Флуоресценция, испускаемая клетками в результате экспрессии GFP, спустя 2-3 дня была зарегистрирована с помощью планшетного ридера TECAN Spark при длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии 510 нм.
- Параллельно были проведены аналогичные эксперименты в культуре клеток N. tabacum (двудольное растение) BY-2 согласно отработанному ранее протоколу (Shakhova et al., 2022; doi: 10.3390/ijms232315441), адаптированному из (Gengenbach, Opdensteinen, and Buyel 2020; doi: 10.3389/fbioe.2020.00393).
- Проведена экспрессия путем агроинфильтраций в листья однодольных растений.
- Для проведения агроинфильтраций был использован тот же штамм агробактерий, который был использован для трансформации суспензионных культур однодольных растений.
- Проведено сравнение результатов, полученных в ряде однодольных культур, с результатами, полученными в культуре N. tabacum (двудольное растение) BY-2
- Проведено сравнение флуоресценции для каждого промотора и терминатора, испускаемой разными культурами однодольных растений.
- Сформулированы выводы о сходимости полученных в проекте данных для разных культур однодольных и двудольных растений.
- Проведено обобщение полученных результатов, проведена оценка результативности исследований и эффективности результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
Все задачи первого этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исследований Соглашения № 075-15-2024-653 (внутренний номер 13.2251.21.0257) о предоставлении субсидии от 28 августа 2024 г.
28 декабря