Научные достижения ГНЦ ИБХ РАН в 2024 году

На заседании Ученого Совета ГНЦ ИБХ РАН 25 декабря 2024 г. были представлены результаты научной деятельности подразделений Института за 2024 год. Вашему вниманию предлагается презентация директора А.Г. Габибова, а также список  достижений, поданных подразделениями на сайте.

достижения ИБХ, отчёт

Гончарук С.А.

Итоговая презентация директора Института А.Г. Габибова

• Скачать в формате PDF
• Публикационная активность отделов и лабораторий представлена на 25 декабря 2024г. Напоминаем, что актуальная статистика всегда доступна на сайте.

Отдел пептидно-белковых технологий

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

CAR T и CAR NK клетки, направленные на общий лейкоцитарный антиген CD45, для кондиционирования перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток и лечения широкого спектра онкогематологических заболеваний

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) широко используется для лечения пациентов с угрожающими жизни гематологическими и иммунными расстройствами. Используемые для кондиционирования в настоящее время химиотерапия и облучение из-за высокой токсичности и неизбирательного действия вызывают множество сопутствующих повреждений во всем организме, что ограничивает применение ТГСК. Более безопасной альтернативой являются иммунотерапевтические агенты на основе моноклональных антител к различным маркерам клеток крови. Однако для полноценной элиминации опухолей необходимы кондиционирующие агенты на основе цитотоксических иммунных клеток. Для этого были получены CAR T и CAR NK клетки, направленные на CD45 на гемопоэтических клетках (CAR45 T, CAR45 NK клетки). Чтобы избежать фратрицида (кросс-цитотоксичности), в CAR Т и CAR NK клетках нокаутировали ген PTPRC, кодирующий CD45 (CD45Δ) и нарабатывали клетки после модификации в присутствии обратимого ингибитора тирозиновых киназ дазатиниба. CD45Δ CAR45 T-клетки элиминируют CD45-позитивные клетки крови человека, включая злокачественные, как in vitro, так и in vivo, что было продемонстрировано на релевантных животных моделях. Аналогично, CD45Δ CAR45 NK клетки уничтожают человеческие PBMC in vitro. Таким образом, мы получили данные доклинической эффективности разработанных CAR45 T и CAR45 NK клеток, устойчивых к фратрициду и направленных против опухолей и гемопоэтических клеток, экспрессирующих CD45.

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

Новые аутоантигены, презентированные на аллелях MHCII, связанные с Ревматоидным Артритом

Создана фаг-дисплейная библиотека фрагментов аутоантигенных белков для поиска новых лигандов MHCII, ассоциированных с аутоимунными болезнями

Предложен метод двумерного скрининга аутоантигенных фрагментов на базе фагового дисплея в сочетании с масс-спектрометрическим анализом иммунопептидома MHCII больных РА

Обнаружена панель новых потенциально –значимых при РА аутоантигенов, презентируемых ассоциированными аллелями MHCII DRB1*01:01 и DRB1*04:01

Впервые показана активация Т клеток в крови больных РА одним из найденных аутоантигенов – фрагментом белка аннексина 11

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

2D скрининг библиотеки антител против широкого репертуара антигенов

Идентификация высокоаффинных антител в сыворотке крови человека является нетривиальной задачей из-за чрезвычайно малого количества циркулирующих В-клеток с заданной специфичностью. В лаборатории биокатализа был предложен эффективный подход, позволяющий идентифицировать высокоаффинные антитела против белков патогена с одновременным картированием эпитопов, даже при отсутствии информации о конкретной структуре иммуногенов данного патогенна. Для скрининга терапевтических антител в крови выздоровевших доноров достаточно только транскриптома патогена, на основании которого и создается полипептидная библиотека антигенов, экспонированных на поверхности бактериофага.

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

Высокая гетерогенность перекрестно-реактивных иммуноглобулинов при рассеянном склерозе предполагает комбинирование В-клеточных эпитопов для диагностики: исследование случай-контроль.

С использованием технологии фаговой иммунопреципитации (PhIP-Seq) была предложена панель потенциальных биомаркеров, позволяющих диагностировать рассеянный склероз.

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

, 

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

Новая физиологическая роль основного белка миелина в наследственных деменциях и противовирусном ответе

Cчитается, что неврологические проявления, связанные с COVID-19, вызваны воспалением и гипоксией, а не непосредственным повреждением клеток в результате вирусной инфекции нейрональных клеток SARS-CoV-2. Однако, недавно было показано, что церебральная экспрессия белка SARS-CoV-2 ORF3a приводит к нейродегенерации, нарушению аутофагосомно-лизосомального пути и накоплению α-синуклеина и гликосфинголипидов в нейронах. В нашей работе мы показали, что основный белок миелина (МВР) взаимодействует и колокализуется с белком ORF3a в клетках млекопитающих и вследствие наличия основного заряда противодействует ORF3a-опосредованному ингибированию аутофагии. Вместе с этим, мы продемонстрировали, что МВР ослабляет расщепление фурином интегрального мембранного белка 2B (Bri2), ассоциированного с семейными деменциями, и замедляет его транслокацию через мембрану. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что МВР играет более активную роль в гомеостазе олигодендроцитов, которая не ограничивается исключительно поддержанием структуры миелиновой оболочки.

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

, 

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Исследования динамики протонирования в активных участках холинэстераз

Холинэстеразы — хорошо известные и широко изученные ферменты, имеющие решающее значение для здоровья человека и участвующие в неврологии, болезни Альцгеймера и метаболизме липидов. Модель протонирования активных участков холинэстераз влияет на все химические процессы внутри, включая реакцию, ковалентное ингибирование нервно-паралитическими агентами и реактивацию. Несмотря на свою значимость, наше понимание тонкой структуры холинэстераз остается ограниченным. В этом исследовании мы использовали квантово-механические/молекулярно-механические расчеты с улучшенной выборкой, чтобы показать, что холинэстеразы в основном работают как динамические смеси двух состояний протонирования. Перенос протона между двумя некаталитическими остатками глутамата следует механизму Гротгуса, облегчаемому молекулой-медиатором воды. Рассчитанный барьер переноса протона в 1,65 ккал/моль свидетельствует о возможности потенциального существования двух сопряженных водородных связей с низким барьером в ингибированной форме бутирилхолинэстеразы. Эти результаты расширяют наше понимание структурных особенностей, выраженных эволюционно совершенными биокатализаторами ферментами, и являются важным элементом, который нужно учитывать в исследованиях по разработке белков и лекарств, связанных с холинэстеразой.

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

, 

Лаборатория антибиотикорезистентности (Терехов С.С.)

, 

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Защитный антимикробный эффект химерного белка на основе фрагментов структуры протеазы IgA1 для создания вакцин против Neisseria meningitidis.

Протеаза IgA1 является одним из факторов вирулентности Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и других возбудителей бактериального менингита. Целью данного исследования является создание рекомбинантных белков на основе фрагментов зрелой протеазы IgA1 A28–P1004 из штамма N. meningitidis серогруппы B H44/76. Данные белки являются потенциальными компонентами противоменингококковой вакцины для защиты от инфекций, вызываемых патогенными штаммами N. meningitidis и другими бактериями, продуцирующими протеазы IgA1 серинового типа. В ходе исследования выбраны антигены для создания мРНК-вакцины против бактериальных инфекций, в которых одним из факторов вирулентности является IgA1-протеаза (N.meningitidis, H.influenzae, N.gonorrhoeae). Разработана модель острой септической инфекции N.meningitidis для оценки протективного эффекта вакцина на основе фактора вирулентности протеазы IgA1. Полученные результаты являются основой для создания противоменингококковых вакцин с использованием современных технологий, в том числе мРНК-вакцин

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

Нанотело Е9 как инструмент изучения структуры и регуляции Lon-протеазы E. coli

АТР-зависимые Lon-протеазы играют ключевую роль в системе контроля качества клеточного протеома. Модельный фермент семейства – Lon-протеаза из E. coli (EcLon) – включает пролонгированную N-концевую область, высокая подвижность которой препятствует определению 3D-структуры фермента. В целях уточнения структуры этой области и изучения регуляции EcLon использовано рекомбинантное нанотело Е9 альпаки, полученное к полноразмерному ферменту, и отобранное на его N-концевой фрагмент. Установлено, что E9 является эффективным аллостерическим ингибитором, подавляющим как АТР-зависимый процессивный гидролиз ферментом белкового субстрата, так и его АТР-азную и пептидазную активности. С помощью крио-ЭМ выявлен спектр олигомерных форм EcLon-протеазы: додекамеров и неизвестных ранее ундекамеров и декамеров, образованных пента- и гексамерами фермента. Обнаружено, что присутствие нанотела Е9 приводит к преобладанию декамерного комплекса в препаратах. Установлено, что связывание Е9, происходящее на интерфейсе декамера, стабилизирует конформацию N-концевой области EcLon. Выдвинуто предположение о том, что различия олигомерных состояний могут определять содержание активных белков EcLon в системе и их функциональность.

Лаборатория антибиотикорезистентности (Терехов С.С.)

, 

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

, 

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

, 

Группа химии природных соединений (Михайлов А.А.)

Комбинация подходов геномного майнинга и молекулярного моделирования для определения механизма биосинтеза антибиотика ирумамицина

Ирумамицин (Iru) — сложный поликетид с ярко выраженной противогрибковой активностью. Iru имеет ряд уникальных структурных особенностей, включающих полукетальное кольцо и эпоксидную группу. В этом исследовании мы провели подробный анализ кластера генов биосинтеза Iru, что позволило детализировать механизм синтеза Iru. Было показано, что полукетальное кольцо формируется в результате миграции двойной связи с помощью поликетидсинтазы и циклизации, опосредованной TE доменом. Кроме того, были идентифицированы предполагаемые декорирующие ферменты, опосредующие образование специфичного для Iru эпоксида. Выявленный механизм биосинтеза Iru раскрывает особенности ферментативных процессов, вовлеченных в продукцию Iru, включающих синтез ядра и декорирование макроцикла. Найденные механистические детали открывают новые возможности для создания целевой архитектуры новых аналогов макролидов с использованием подходов синтетической биологии и биосинтетической инженерии. На рисунке представлены кластер генов биосинтеза ирумамицина, схема сборки ядра и декорирования макроцикла, а также механистическая структурная модель финальных стадий элонгации и макроциклизации.

Лаборатория антибиотикорезистентности (Терехов С.С.)

, 

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Лаборатория рационального дизайна химиотерапевтических агентов (Осипова (Каськова) З.М.)

, 

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Поиск аминонуклеозид синтетаз в геномах бактерий позволил детализировать механизмы биосинтеза и антибиотикорезистентности антибиотика цистоцина.

Природный аминонуклеозидный антибиотик пуромицин находит широчайшее применение в молекулярной и синтетической биологии. Благодаря уникальному механизму своего действия, он используется для селекции генетически модифицированных клеточных линий, мониторинга синтеза белка in situ и изучения функционирования про- и эукариотических рибосом. Несмотря на свою известность, ключевой этап биосинтеза пуромицина оставался неизвестным. Исследование биоразнообразия кластеров биосинтеза аминонуклеозидных антибиотиков показало, что ключевой фермент Pur6 использует в качестве субстрата аминоацилированную тРНК в качестве активированного пептидильного предшественника. Подробный метаболомный анализ штамма Streptomyces sp. VKM Ac-502, несущего уникальный кластер биосинтеза цистеин-содержащего аминонуклеозида, позволил идентифицировать аналог пуромицина на основе цистеина — цистоцина. Подобно пуромицину, цистоцин ингибирует как прокариотическую, так и эукариотическую трансляцию, встраиваясь в растущую полипептидную цепь. Анализ механизма биосинтеза цистоцина также позволил идентифицировать новый фермент антибиотикорезистентности – аминонуклеозид N-ацетилтрансферазу CstC. CstC инактивирует цистоцин, опосредуя устойчивость к аминонуклеозидным антибиотикам в генетически модифицированных бактериях и клетках человека. Полученные результаты могут быть использованы для идентификации новых аминонуклеозидов и ферментов антибиотикорезистентности, а также расширяют наши практические возможности в области молекулярной и синтетической биологии.

На рисунке представлена ключевая стадия биосинтеза пуромицина, предполагаемая структура ключевого фермента биосинтеза Pur6, биоразнообразие кластеров биосинтеза аминонуклеозидных антибиотиков, а также предполагаемая структура фермента антибиотикорезистентности – аминонуклеозид N-ацетилтрансферазы CstC.

Лаборатория микрофлюидных технологий для биомедицины (Тоневицкий А.Г.)

Математическая модель выявила ключевые различия в динамике вариантов SARS-CoV-2 Omicron и Delta

Разработана математическая модель, объясняющая различия в репликации и патогенности вариантов SARS-CoV-2 Omicron и Delta в клетках человеческого кишечного эпителия (Caco-2) и легочного эпителия (Calu-3). Уточненная система интегро-дифференциальных уравнений, адаптированная к экспериментальным данным, выявила три ключевых параметра: сниженная скорость проникновения Omicron в клетки, усиленное производство цитокинов и повышенная устойчивость неинфицированных клеток к заражению. Это достижение проливает новый свет на особенности взаимодействия вируса и клеток для различных вариантов и расширяет возможности применения математического моделирования в исследованиях in vitro.

Лаборатория микрофлюидных технологий для биомедицины (Тоневицкий А.Г.)

, 

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

Дизайн малых шпилечных РНК для сверхэкспрессии микроРНК: предотвращение нежелательных 5'-изоформ микроРНК

Были выявлены критические проблемы в подходе к стабильной сверхэкспрессии микроРНК с использованием малых шпилечных РНК (shRNA). Мы обнаружили, что добавление U-хвостов на 3'-конце shRNA при транскрипции с помощью РНК-полимеразы III может смещать положение расщепления белком Dicer, что приводит к образованию 5'-изоформ микроРНК с измененными сид-регионами. Эти нежелательные изоформы не обнаруживаются методом ПЦР-РВ, но могут быть выявлены с помощью секвенирования нового поколения, направленного на малые РНК, включая микроРНК, и анализа мишеней мРНК, что показывает их потенциальные регуляторные функции. Это открытие подчеркивает необходимость тщательной разработки структур shRNA для точной экспрессии необходимых микроРНК и предотвращения ошибочных функциональных интерпретаций.

Отдел иммунологии

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

, 

Лаборатория методов иммуносеквенирования (Чудаков Д.М.)

Выявлены антиген-специфичные реакции NK-клеток при hCMV и SARS-CoV-2

Определён ответ NK-клеток в CD3-негативных образцах PBMC на пептид VMAPRTLFL (LFL), содержащийся в белке UL40 цитомегаловируса (hCMV), и коммерческие наборы пептидов SARS-CoV-2 (ppSARS). При стимуляции NK-клеток пептидами обнаружено увеличение продукции IFNγ, дегрануляции, активации и пролиферации по сравнению с контрольными образцами без пептида у доноров, обладающих высокими титрами антител к hCMV и SARS-CoV-2, в то время как NK-клетки серонегативных доноров не демонстрировали ответа на соответствующую стимуляцию. Результаты РНК-секвенирования подтвердили увеличение гена KLRC2, кодирующего рецептор NKG2C, в образцах, стимулированных пептидом LFL, тогда как образцы стимулированные пептидами SARS-CoV-2, продемонстрировали увеличение экспрессии гена, кодирующего активирующий рецептор KIR2DS4. Результаты данного исследования расширяют понимание адаптивного иммунного ответа NK-клеток на вирусные инфекции, вызванные hCMV и SARS-CoV-2.

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

, 

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Определены различия цитотоксических эффектов клеточной линии NK-92 и первичных NK-клеток против сфероидов разных типов опухолевых клеток, которые обусловлены конкретными рецептор-лиганд взаимодействиями

Терапевтическая эффективность клеточных препаратов на основе NK-клеток против различных опухолей может различаться и зависеть от опухолевых детерминант. Было проведено прямое одновременное сравнение цитотоксических эффектов, а также секреторной активности in vitro-активированных периферических NK-клеток (pNK) и клеток NK-92 в сфероидных моделях карцином BT-474, MCF-7 и SKOV-3, которые являются клеточными линиями, широко применяемыми в моделях ксенотрансплантатов из-за их высокого опухолеобразующего потенциала. Использование трехмерных опухолевых сфероидов позволило нам получать данные с улучшенной биологической значимостью. Сфероиды схожего размера и формы инкубировались с клетками NK-92 или pNK, а гибель опухолевых клеток определялась с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Опухолевые сфероиды из клеток BT-474 показали схожую низкую восприимчивость к эффекторам pNK и NK-92. Вместе с тем, клетки NK-92 и pNK оказывали цитотоксическое действие на сфероиды MCF-7 и SKOV-3 разной степени. Анализ влияния эффектор–мишень, связанный с уровнями рецепторов NK-клеток и их лигандов на опухолевых клетках, подтвердили участие NKG2D-NKG2DL взаимодействия в активации pNK-клеток против наиболее чувствительных сфероидов из SKOV-3, тогда как полученные данные предполагают существенное участие оси CX3CR1-CX3CL1 в реакции pNK против сфероидов MCF-7. Таким образом, определены различия цитотоксических эффектов клеточной линии NK-92 и первичных NK-клеток против сфероидов разных типов опухолевых клеток, которые обусловлены конкретными рецептор-лиганд взаимодействиями. Предварительная идентификация наиболее перспективных рецепторов NK-клеток, селекция позитивных по этим маркерам pNK, их накопление и/или генетическая модификация могут усиливать эффективность таргетной терапии рака за счет улучшения их специфичности и реактивности.

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

, 

Лаборатория методов иммуносеквенирования (Чудаков Д.М.)

Определены способы накопления NK-клеток с адаптивными характеристиками

Способы накопления NK-клеток, обладающих характеристиками адаптивных NK-клеток, были изучены в ходе данных работ. Экспрессия HLA-DR в NK-клетках in vitro может быть вызвана как посредством стимуляции экзогенными IL-2 и IL-21, так и посредством аутостимуляции IFNγ, продуцируемым NK-клетками. На внутриклеточном уровне экспрессия HLA-DR зависела от активации путей, опосредованных STAT3 и ERK1/2, с последующей активацией изоформы 3 транскрипционного фактора CIITA. Мы продемонстрировали, что особенности транскриптома HLA-DR+CD56bright NK-клеток свидетельствует об их повышенном пролиферативном потенциале, что было подтверждено при стимуляции комплексом K562-21E/пептид. Кроме того, NK-клетки, стимулированные K562-21E/пептидом, характеризовались накоплением CD57− KIR2DL2/3+ NKG2C+NKG2A−клеток, которые предположительно представляют собой предшественники адаптивных NK-клеток. Полученные результаты расширяют знания о разнообразии и функциях NK-клеток с адаптивными свойствами, что может быть полезно для оценки их возможного применения в иммунотерапии.

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Инновационные контактные линзы, модифицированные металлоорганическими каркасами, для лечения глаукомы

На основе высокопористых металорганических каркасов разработан метод модификации поверхности контактных линз. Результатом модификации поверхности линз является пролонгированное высвобождение лекарства бримонидина, используемого для снижения внутриглазного давления при глаукоме. В опытах in vivo на кроликах была показана безопасность и эффективность модифицированных линз.

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Фаза I клинических испытаний нового радиофармпрепарата [99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 на основе скаффолдного белка EC1 для визуализации рака легкого с гиперэкспрессией EpCAM

Методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) на 12 пациентах проведено изучение безопасности, биораспределения и переносимости радиофармпрепарата на основе скаффолдного белка [^99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 для диагностики и оценки эффективности лечения рака легкого с гиперэкспрессией молекулы адгезии эпителиальных клеток EpCAM. Результаты исследования показали безопасность препарата и его хорошую переносимость пациентами. Значения поглощенной дозы препарата находятся в допустимых пределах. Препарат [^99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 показал диагностическую эффективность в формате SPECT при визуализации EpCAM-положительных опухолей и регионарных метастазов. Использование [^99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 в SPECT позволит проводить отбор пациентов для таргетной иммунотерапии опухолей и оценку эффективности такого лечения.

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

, 

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Расположение модулей в адресном комплексе существенно влияет на взаимодействие с альбумином в кровотоке и связывание с опухолью

Для предотвращения почечной фильтрации и увеличения времени циркуляции в кровотоке HER2-специфичный модуль DARPin_G3 конъюгировали с альбумин-связывающим доменом ABD (А). Установлено, что порядок функциональных модулей в гибридном белке влияет на взаимодействие с альбумином in vivo: константа ассоциации с альбумином для ABD-DARPin_G3 в 15 р меньше, чем для DARPin_G3-ABD, что и определяет время циркуляции в кровотоке и биораспределение этих белков (Б). Конъюгация DARPin_G3 с ABD увеличивает накопление препарата (как 177Lu-G3-ABD, так и 177Lu-ABD-G3) в опухоли по сравнению с адресом 177Lu-G3 без ABD-домена (Б, В).

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

, 

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Стириловые красители для измерения вязкости и выявления патологических процессов в живых клетках

Получена серия молекулярных роторов на основе стириловых красителей, изучен потенциал их применимости для мониторинга параметров живых клеток. Соединения локализовались в митохондриях, давая высококонтрастные конфокальные изображения без отмывки от несвязавшегося с клетками красителя. Показано, что квантовый выход и время жизни флуоресценции увеличиваются при возрастании вязкости среды, а также в присутствии белков и ДНК. В результате наглядно продемонстрировано, что эти молекулярные роторы нельзя использовать как сенсоры вязкости в клетках из-за взаимодействия с биомолекулами. Полученные данные ставят под сомнение результаты множества опубликованных ранее работ по применению молекулярных роторов в качестве внутриклеточных вискозиметров. В то же время результаты нашей работы показывают, что молекулярные роторы на основе стириловых красителей и гомологичных им соединений можно использовать для мониторинга патологических состояний клетки.

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

, 

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Улучшение эффективности связывания с раковыми клетками в условиях ацидоза за счёт оптимизации структуры отдельных компонентов мультидоменных конструкций на основе флуоресцентных белков и пептидов семейства pHLIP

Получена серия новых мультидоменных белково-пептидных конструкций, эффективно связывающихся с раковыми клетками в условиях пониженного рН. Показано, что значительное влияние на эффективность рН-зависимого связывания, а также на свойства белковой компоненты в составе гибридной конструкции оказывает не только структура нацеливающего домена pHLIP, но и аминокислотная последовательность междоменного линкера. Оптимизируя структуру линкера, удалось существенно увеличить эффективность связывания конструкций с сохранением заданной чувствительности к рН.

Отдел структурной биологии

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

Трансмембранные домены нейротрофиновых рецепторов - мишень для антидепрессантов

Нейротрофины и их рецепторы являются важнейшей системой, ответственной за развитие и дифференцировку нервных клеток. Недавно была предложена гипотеза, согласно которой эффект от принятия антидепрессантов обсусловлен их взаимодействием с трансмембранным доменом нейротрофиновых рецепторов. В серии работ международного коллектива была исследована структура трансмембранного домена рецептора TrkB, а также взаимодействие рецепторов TrkB и P75 с антидепрессантами. Впервые удалось получить структуру трансмембранного домена TrkB, соответствующую активному состоянию рецептора, а также показать прямое взаимодействие флуоксетина (препарат "Прозак") с трансмембранными доменами рецепторов TrkB и P75. В свою очередь это позволило предложить механизм действия антидепрессантов: связывание с рецептором стабилизирует его активное состояние. Результаты исследований могут объяснить долговременный эффект от приема антидепрессантов и лечь в основу разработки новых высокоэффективных лекарств.

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Молекулярные механизмы активности клеточно-проникающего пептида CpRE12 из протеома яда медузы Rhopilema esculentum

Достижения в области медицины и фармакологии привели к разработке систем, которые доставляют биологически активные молекулы внутрь клеток, увеличивая концентрацию лекарств в целевых участках. Это повышает эффективность и продолжительность действия и снижает побочные эффекты на здоровые ткани. Клеточно-проникающие пептиды (CPP) показывают многообещающие результаты в этой области. С помощью разработанного прогностического алгоритма на основе методов машинного обучения были обнаружены и протестированы на цитотоксичность и проникающую способность в клетки млекопитающих ряд потенциальных клеточно-проникающих пептидов. В ходе данного исследования для нового малотоксичного клеточно-проникающего пептида CpRE12 из протеома яда медузы Rhopilema esculentum с помощью ЯМР-спектроскопии и молекулярной динамики были описаны структурно-динамические свойства, детализированы межмолекулярные взаимодействия и разработана молекулярно-биофизическая модель проникновения через мембрану клетки.

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Лаборатория химии липидов (Водовозова Е.Л.)

Полимер SMA и его производные - характеризация и применение

Полимер SMA и его производные позволяют экстрагировать белки из мембраны, что делает их удобным инструментом при исследовании мембранных белков. Совместные работы с коллегами из ИФХЭ РАН по изучению полимера SMA позволили раскрыть механизм конформационного перехода, вызванного изменением pH, и на фундаментальном уровне объяснить процесс агрегации молекул SMA. Кроме того, были предложены производные SMA и разработаны протоколы их получения. Показано, что новые полимеры способны связывать липиды и образовывать небольшие диски, которые описываются моделью "идеальной бицеллы", а липиды в их составе способны претерпевать фазовые переходы. Также было установлено, что данные полимеры можно использовать для извлечения мембранных белков из липосом и клеточных мембран. Все это делает их перспективными средами для исследования мембранных белков.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Липидные нанодомены формируют «динамический молекулярный портрет» смешанных бислоев в жидкой фазе

Латеральная гетерогенность, или мозаичность, – фундаментальное свойство клеточных мембран, имеющее ключевое значение для их функционирования. Методами in silico изучены наномасштабные неоднородности (нанодомены, НД) в смешанных бислоях диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ) и диолеоилфосфатидилсерина (ДОФС). Предложен новый алгоритм идентификации НД, который, в отличие от предшествующих, учитывает неоднородное распределение атомной плотности липидных головок и не зависит от субъективно подобранных параметров. Применение алгоритма к модельным системам показало, что в мембранах, обогащенных ДОФС, липиды формируют более компактные и стабильные НД благодаря сильным межлипидным взаимодействиям, отсутствующим у ДОФХ. Такая картина латеральной гетерогенности тесно связана с физическими свойствами поверхности бислоя: системы, обогащенные ДОФС, демонстрируют более выраженную поверхностную гетерогенность гидрофильных/гидрофобных областей. Полученные результаты дают основу для понимания «динамического молекулярного портрета» поверхности бислоя, количественные характеристики которого открывает возможности для рационального дизайна искусственных мембран с заданными свойствами, используемыми как для фундаментальных исследований, так и для биомедицинских приложений, в частности, модуляции проницаемости мембран и разработки супрамолекулярных комплексов для доставки лекарств.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

“Молекулярные портреты” охарактеризовали функциональные состояния ионных каналов TRPV

Ионные каналы TRPV отличаются большим разнообразием функций в клетке, принимая участие в температурной и болевой чувствительности, делении клеток, усвоении кальция и т.д. Проанализированы атомарные структуры ключевого домена TRPV – ион-проводящей поры в различных состояниях. В исследовании был применен оригинальный аналитический подход “динамического молекулярного портрета” (ДМП), направленный на картирование физико-химических свойств молекулярных поверхностей и межмолекулярных взаимодействий. Один из вариантов ДМП, использованный в работе – построение 2D проекций (карт) распределения гидрофобных и гидрофильных свойств поверхности поры. Метод построения карт реализован в виде web-инструмента “Molecular Surface Topography” (MST) (https://model.nmr.ru/cell). Выявили три консервативных состояния поры, общие для всех TRPV: α-закрытое, π-закрытое и π-открытое. Показано, что α-закрытое состояние является наиболее стабильным, гидрофобным и всегда непроводящим, тогда как π-закрытое менее стабильно и может переходить в открытое состояние с благоприятным для проведения ионов распределением гидрофобности. Подход ДМП может быть полезен для классификации функциональных состояний ионных каналов других типов.

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

Растительный полифенол ресвератрол является ингибитором поли-(АДФ-рибоза-)полимеразы 1 (PARP1)

Растительный полифенол ресвератрол - это биологически активное соединение, обладающее антиоксидантным, противовоспалительным, антибактериальным, противовирусным, геропротекторным и противоопухолевым действием.

Обнаружено, что ресвератрол ингибирует активность PARP1 в микро- и субмикромолярных концентрациях, но ингибирование снижается при более высоких концентрациях из-за агрегации полифенола.

Конкуренция между талазопарибом и ресвератролом за связывание с PARP 1 указывает на то, что ресвератрол, подобно талазапарибу, взаимодействует с сайтом связывания НАД+.

Ингибирование ресвератролом PARP 1 сопровождается снижением аффинности PARP1 к нуклеосомальной ДНК.

Работа выполнена в сотрудничестве с учеными из Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и Онкологического центра Фокс Чейз (США).

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

, 

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

Исследование структуры и термодинамики в мембраноподобной среде позволило выявить механизм димеризации антимикробного пептида из морской полихеты

Пептид капителлацин морской полихеты Capitella teleta проявляет антимикробную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая антибиотикорезистентные штаммы, при этом обладая пониженной гемолитической активностью. Это делает его перспективным объектом для поиска новых антибиотиков.

Мы методом ЯМР исследовали пространственную структуру и термодинамические параметры процесса димеризации капителлацина в мембраномоделирующей среде — мицеллах детергента DPC.

Было показано, что капителлацин в мицеллах образует две структурные формы – мономерную β-шпильку и димер, который образуется путем антипараллельной ассоциации N-концевых тяжей пептида. Обе структурные формы капителлацина связываются с поверхностью мицеллы. В спектрах ЯМР мы наблюдали и количественно охарактеризовали переходы между этими формами, происходящие при изменении температуры и соотношения концентраций пептида и детергента. Было обнаружено, что процесс формирования димера характеризуется отрицательным изменением энтальпии и энтропии. Это говорило о том, что процесс димеризации происходит за счет взаимодействия полярных или слабо гидрофобных областей мономеров и зависит в большей степени от межмолекулярных взаимодействий (водородных связей, электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий), нежели от гидрофобного эффекта.

Полученные данные согласуются с “ковровым” механизмом действия на мембраны бактерий, что объясняет более низкую антибактериальную, гемолитическую и мембранолитическую активность капителлацина по сравнению с другими подобными пептидами.

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

, 

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

, 

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

Установлены структура и механизм анальгетического эффекта пептида морской анемоны Heteractis magnifica HCIQ2c1

TRPA1 — неселективный кальций-проницаемый канал, участвующий в процесса химической и температурной чувствительности, острой боли и развития воспаления. Пептидные модуляторы канала TRPA1 служат молекулярными инструментами для исследования его физиологической активности и представляют собой перспективную основу для поиска анальгетиков и противовоспалительных средств нового типа.

Мы исследовали токсин из морской анемоны Heteractismagnifica HCIQ2c1, который относится к ингибиторам сериновых протеаз Кунитц-типа. На опытах in vivo было показано, что HCIQ2c1 значительно уменьшает боль и воспаление у мышей, вызванные AITC и капсаицином — низкомолекулярными агонистами TRPA1. Электрофизиологические эксперименты в ооцитах Xenopuslaevis, экспрессирующих канал rTRPA1 крысы, показали, что HCIQ2c1 связывается с открытым rTRPA1 и предотвращает его переход как в закрытое, так и нечувствительное к ингибиторам «гиперактивированное» состояние.

Методом ЯМР была исследована структура и динамика HCIQ2c1 в растворе, что позволило методами молекулярного моделирования построить полноатомную модель комплекса HCIQ2c1-rTRPA1 в явно заданной мембране. Согласно полученной модели, в комплексе HCIQ2c1/TRPA1 пептид взаимодействует одновременно с одним VSL-доменом и двумя фрагментами порового домена из разных субъединиц канала, связываясь с длинной внеклеточной петлей S1-S2 VSL-домена при помощи L-петель, а с интерфейсом между поровыми доменами – посредством протяженной β-шпильки. Следует заметить, что выявленные методом ЯМР наиболее подвижные участки основной цепи HCIQ2c1 (в диапазонах пс-нс и мкс-мс), совпали с предсказанными моделью сайтами взаимодействия токсин-канал.

Полученная модель объясняет стабилизацию канала в открытой конформации и снижение вероятности перехода в «гиперактивированное» состояние, что, вероятно, обуславливает наблюдаемую анальгетическую активность.

Работа выполнена совместно с Лабораторией молекулярной фармакологии и биомедицины ТИБОХ ДВО РАН.

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

, 

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии (Василевский А.А.)

Как токсин скорпиона BeKm-1 блокирует калиевый канал сердца hERG: роль незаменимого остатка аргинина

Причина кардиотоксичности многих ядов — блокирование сердечной изоформы калиевого канала hERG (Kv11.1): на него действует и пептидный токсин из яда скорпиона BeKm-1. Несмотря на наличие пространственных структур и канала, и токсина, 3D-строение их комплекса в точности не установлено, что не позволяет подступиться к перспективным фармацевтическим задачам. В этой работе, используя подходы ансамблевого докинга и молекулярной динамики, а также биохимические данные по сопряжению остатков токсин—канал, полученные ранее в нашем институте, мы построили модель 3D-структуры комплекса hERG—BeKm-1, подсказавшую уникальную роль остатка токсина R20, образующего множественные связи с вестибюлем канала. Модель и экспериментальная проверка показали, что даже «несущественная» замена BeKm-1R20K приводит сильному падению блокирующей активности, подтверждая точность модели и ее потенциал для снижения кардиотоксичности и драг-дизайна, направленного на родственные мишени (например, калиевый канал мозга EAG).

Отдел геномики и постгеномных технологий

Лаборатория структуры и функций генов человека (Чернов И.П.)

Пространственная структура хроматина гена KLF5 в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

KLF5 – многофункциональный фактор транскрипции, участвующий во множестве клеточных процессов, и связанный с различными видами рака.

Методом циркулярной идентификации конформации хромосомы (4C-seq) мы определили пространственную организацию хроматина регуляторных областей гена KLF5, в высокодифференцированных клетках рака поджелудочной железы (РПЖ) Capan2 с высоким уровнем экспрессии KLF5 и в низкодифференцированных клетках РПЖ MIA PaCa2 c низким уровнем экспрессии этого гена. Этот подход позволил нам выявить, что:

• количество и распределение контактов регуляторной области KLF5 с другими областями хроматина в этих типах клеток существенно различаются, в линии Capan2 число контактов значительно выше;
• в линии Capan2 интенсивность активирующих хроматин модификаций гистона H3 значительно выше, чем в MIA PaCa2. Этому соответствует и повышенный в клетках Capan2 уровень экспрессии большинства генов этой области;
• только для клеток линии Capan2 характерен высокий уровень контактов регуляторной области KLF5 со свободным от генов участком генома, содержащим кластер ассоциированных с РПЖ SNP.

Таким образом, при повышении степени злокачественности клеток уменьшается общее число контактов промоторной области гена KLF5, понижается степень модификации гистона H3, характерных для активного хроматина, и уровень экспрессии большинства окружающих KLF5 генов.

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза (Зарайский А.Г.)

Утрата способности к регенерации конечностей у высших позвоночных: от побочных эффектов эволюционных инноваций до потери генов

Сотрудники лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ГНЦ ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и отдела регенеративной медицины РНИМУ Н.И. Пирогова выяснили основные факторы, сделавшие невозможной регенерацию конечностей у современных амниот (рептилии, птицы и млекопитающие). После выхода предков амниот на сушу способность к регенерации конечностей у них оказалась подавленной побочными эффектами ряда возникших в это время инноваций, необходимых для успешной колонизации суши. Это, в свою очередь, стимулировало исчезновение многих генов, переставших с этого момента участвовать в регенерации. В частности, авторы показали, что у плацентарных млекопитающих, в том числе у человека, неспособность к регенерации конечностей оказалась жестко зафиксированной на геномном уровне в виде отсутствия порядка 150 генов, необходимых для регенерации конечностей у рыб и амфибий. При этом большинство из этих генов участвуют у рыб и амфибий в регуляции только самой ранней стадии регенерации. Именно поэтому исчезновение этих генов у амниот, в том числе у человека, заблокировав регенерацию конечности, не привело одновременно к нарушению ее развития эмбриогенезе. Дело в том, что механизмы, управляющие ранней стадией регенерации конечностей, существенно отличаются от механизмов, участвующих в раннем эмбриональном развитии конечностей. Напротив, поздние стадии регенерации конечностей и эмбриональное развитие конечностей контролируются очень похожими генетическими программами.

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Гурская Н.Г.)

Наблюдения за изменениями эпигенетических модификаций гистонов в живых клетках

Пострансляционные модификации гистонов, таких как метилирование и ацетилирование по определенным остаткам лизина (например, H3K9me3, H3K9ac и H3K4me1), играют ключевую роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов и могут быть связаны с различными заболеваниями. Изучение эпигенетики может иметь как практическое (скрининг и тестирование новых лекарственных форм), так и фундаментальное значение для понимания процессов клеточной дифференцировки, старения, ответа на стресс и др. Вместе с тем, методы наблюдения за эпигенетическими модификациями в живых клетках остаются практически неразвитыми.

Для решения этой проблемы мы разработали новый подход, LiveMIEL (микроскопическая визуализация эпигенетического ландшафта живых клеток). LiveMIEL включает в себя визуализацию эпигенетических модификаций с помощью генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров и дальнейший анализ полученных внутриядерных паттернов путем многопараметрического анализа изображений. Был получен ряд новых эпигенетических сенсоров с различной специфичностью и цветами флуоресценции, а также разработан протокол обработки и классификации изображений ядер живых клеток с использованием алгоритмов машинного обучения на основе около ста характерных черт (feature) паттернов в каждом ядре.

Один из эпигенетических сенсоров, MPP8-Green, был использован для мониторинга изменений маркера гетерохроматина H3K9me3 в ходе дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК) в нейрональном направлении. Прижизненная микроскопия позволила отслеживать изменения в флуоресцентном сигнале MPP8-Green в ядрах клеток на протяжении четырех дней дифференцировки. LiveMIEL позволил выявить две основные волны эпигенетических изменений – в первые 8 ч и на третьи сутки дифференцировки. Дальнейшее изучение этих периодов с применением классических методов анализа эпигенома (например, ChIP-Seq или Hi-C) может привести к открытию новых механизмов, регулирующих процесс дифференцировки.

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Гурская Н.Г.)

Флуоресцентный сенсор, имитирующий естественную мишень, для обнаружения активности протеазы PLpro коронавируса SARS-CoV-2 и вирусной инфекции в живых клетках

Папаин-подобная протеаза PLpro играет ключевую роль в жизненном цикле вируса SARS-CoV-2. Она отвечает за первые события расщепления полипротеина на отдельные белки (nsp1-4) и подавляет клеточный иммунитет. Мы получили новый генетически кодируемый флуоресцентный сенсор - PLpro-ERNuc, основанный на транслокации флуоресцентного сигнала с цитоплазматической поверхности эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в ядро клетки. Важной особенностью нового сенсора является то, что он максимально приближен по структуре к природной мишени PLpro. Тестирование PLpro-ERNuc на модели рекомбинантной PLpro, экспрессируемой в клетках HeLa показало эффективную транслокацию зеленого сигнала в ядра клеток, экспрессирующих PLpro (увеличение соотношения сигнала ядро/цитоплазма в 14 раз). На модели клеток Huh7.5, инфицированных вирусом SARS-CoV-2, репортер показал значительную транслокацию зеленого сигнала из эндоплазматического ретикулума в ядро через 24 часа после инфекции. Сенсор PLpro-ERNuc может найти применение в широкомасштабных скринингах ингибиторов PLpro, а также как инструмент мониторинга распространения вируса в клеточных моделях.

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Гурская Н.Г.)

Рентгеновская пространственная структура яркого красного флуоресцентного белка mKate2-K67R/R197H

Методами рентгеноструктурного анализа и молекулярной динамики (MД) на атомном уровне установлена пространственная структура двойного мутанта красного флуоресцентного биомаркера - mKate2-K67R/R197H (альтернативное имя FusionRed2; λex/λem 579/603 mn) с разрешением 1.5 А. По сравнению с ярким коммерческим предшественником mKate2 исследованный биомаркер демонстрирует дополнительное увеличение яркости флуоресценции в~1.6-раза и представляет собой новое поколение сверх ярких красных флуоресцентных биомаркеров демонстрирующих новые возможности флуоресцентного имиджинга белков в живых клетках. МД расчеты показали, что яркости mKate2-K67R/R197H и его предшественника mKate2 коррелируют с дипольными моментами аминокислотных окружений хромофоров. Чем выше дипольный момент, тем выше яркость.

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Гурская Н.Г.)

Пространственная организация флуоресцентного комплекса тройного мутанта бактериального липокалина с хромофором DiB3-F53L/F74L/L129M

Методом молекулярной динамики установлена пространственная организация DiB3-F53L/F74L/L129M – тройного мутанта флуоресцентного нековалентного комплекса генно-инженерного варианта бактериального белка липокалина Blc с синтетическим GFP-подобным хромофором M739. Установлено, что область связывания хромофора в исследуемом комплексе близка к DiB1 и отличается от альтернативной области в DiB3. Данный комплекс отличается повышенной яркостью флуоресценции по сравнению с комплексами хромофора с другими генно-инженерными вариантами липокалина, что выдвигает его в число перспективных маркеров биологических объектов в клеточной биологии.

Лаборатория химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

, 

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Гурская Н.Г.)

Генетически-кодируемая система мечения на основе флуороген-активирующего белка FAST пригодная для мультиплексирования во флуоресцентной времяразрешенной микроскопии

Предложена генетически-кодируемая система мечения на основе флуороген-активирующего белка FAST пригодная для мультиплексирования во флуоресцентной времяразрешенной микроскопии. Эта система использует мутанты FAST, которые активируют один и тот же флуороген, но обеспечивают разное время жизни флуоресценции для каждой конкретной пары белок-краситель. Все предлагаемые зонды с разным временем жизни обладают почти идентичным и наименьшим в своем классе размером, а также схожими стационарными оптическими свойствами. С использованием этой системы удается одновременно различить до трех различных компонентов живых клеток.

Группа геномного анализа сигнальных систем клетки (Буздин А.А.)

Биоинформатический и клинико-экспериментальный анализ раскрыл механизмы резистентности глиобластомы к темозоломиду и выявил новые комбинированные и индивидуальные биомаркеры выживаемости, превосходящие метилирование промотора MGMT

Глиобластома (ГБМ) - наиболее агрессивная и смертельно опасная опухоль центральной нервной системы. Стратегия лечения в основном включает хирургическое вмешательство и/или лучевую терапию, обе в сочетании с адъювантной химиотерапией темозоломидом (TMZ). Исторически сложилось так, что метилирование промотора гена MGMT используется в качестве основного биомаркера, предсказывающего индивидуальный ответ опухоли на TMZ.

Целью данного исследования было проанализировать гены и молекулярные пути репарации ДНК как биомаркеры чувствительности к лечению TMZ при ГБМ с использованием обновленных данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) и проверить полученные результаты на экспериментальных наборах данных.

Для оценки всех предполагаемых биомаркеров использовали анализ выживаемости пациентов с ГБМ, получавших терапию TMZ, и расчет отношения рисков (HR) на основе коллекции молекулярных профилей проекта TCGA, переклассифицированной нами согласно последним рекомендациям Всемирной организацией здравоохранения CNS5, и экспериментальной многоцентровой когорты пациентов с ГБМ. Уровни активации путей были рассчитаны для 38 путей репарации ДНК. Путь чувствительности к TMZ был реконструирован с помощью интерактомной модели человека, построенной на основе парных взаимодействий, извлеченных из 51 672 молекулярных путей человека.

Мы обнаружили, что уровни экспрессии/активации семи и шести новых биомаркеров генов/путей служат высококачественными положительными и отрицательными, соответственно, биомаркерами выживаемости пациентов, которые работают лучше, чем метилирование промотора гена MGMT. Положительные биомаркеры выживаемости были обогащены процессами ATM-зависимой активации контрольных точек и остановки клеточного цикла, а отрицательные - эксцизионной репарацией ДНК. Мы также построили и охарактеризовали генные пути, которые были информативны для выживания пациентов с ГБМ после введения TMZ (HR 0,18-0,44, p < 0,0009; площадь под ROC-кривой 0,68-0,9).

В данном исследовании комплексный анализ экспрессии 361 гена репарации ДНК и уровней активации 38 путей репарации ДНК выявил 13 потенциальных биомаркеров выживаемости с повышенным прогностическим потенциалом по сравнению с метилированием MGMT. Мы алгоритмически реконструировали путь чувствительности к TMZ с сильным прогностическим потенциалом при ГБМ.

Группа генной иммуноонкотерапии (Алексеенко И.В.)

Генетически-кодируемый ко-активатор иммунных контрольных точек повышает противоопухолевую эффективность anti-PD1/PDL1 терапии за счет привлечения NK клеток и Т-киллеров в опухоль

Терапия ингибиторами иммунных контрольных точек (ИКТ) быстро становится стандартом лечения многих видов рака. Однако подмножество пациентов, которые отвечают на этот вид терапии, ограничено и в среднем составляет около 20%

• В данном исследовании мы объединили терапию ингибиторами ИКТ с дополнительной стимуляцией противоопухолевого иммунного ответа за счет использования генетически-кодируемого ко-активатора ИКТ, OX40L
• В качестве носителя для доставки гена OX40L в опухоли мы использовали сополимер ПЭГ-ПЭИ-ТАТ, ППТ
• Терапия комплексами OX40L/ППТ успешно подавляла рост опухолей в моделях B16F0 и CT26
• Использование OX40L/ППТ привело к увеличению количества внутриопухолевых NK-клеток и T-киллеров, а также снижению количества внутриопухолевых миелоидных клеток
• Комбинация OX40L/ППТ с anti-PD1 ИКТ значительно повысила эффективность ИКТ, обеспечив защитный иммунитет против раковых клеток

Таким образом, использование комбинации иммунной и генной терапии позволило увеличить эффективность иммунной терапии, что в дальнейшем может позволить усовершенствовать существующие иммунотерапевтические подходы

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

, 

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

, 

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

Оптическая детекция единичных вирусных частиц SARS-CoV-2 прямым подсчетом вспышек флуоресценции

В совместной работе с Институтом спектроскопии РАН на уникальной установке с применением субмикрометровых флуоресцентых меток, образованных плазмонными наночастицами, включающими сопряженный флуоресцентный краситель в поли-дофаминовой оболочке, были обнаружены вирионы SARS-CoV-2 в биологическом материале, имитирующем пациентский, в течение 20 минут после забора образца и без стадии концентрирования. Измерения проведены подсчетом числа вспышек на оболочке индивидуальных вирусных частиц. При этом метод легко отличает инфицирующие частицы вируса от дефектных.

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

, 

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

, 

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

, 

Лаборатория молекулярной вирусологии (Рубцов Ю.П.)

, 

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Шахпаронов М.И.)

Пептидные и белковые нейротоксические ингибиторы, селективные к подтипам никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, усиливают пролиферацию клеточных линий глиобластомы

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR), которые играют решающую роль в передаче сигналов центральной нервной системой, широко представлены в головном мозге. Клетки глиобластомы (GBM) экспрессируют несколько подтипов nAChR, которые, как предполагается, передают сигналы от нейронов, способствуя инвазии и росту опухоли. Анализ опубликованных транскриптомов GBM выявил пространственную гетерогенность в экспрессии подтипов nAChR, а функциональные α1*, α7 и α9 подтипы nAChR продемонстрированы в нашей работе на нескольких культурах GBM, полученных от пациентов, и на клеточной линии GBM U87MG с использованием нейротоксинов, селективных к указанным выше подтипам рецептора, методом флуоресцентного анализа мобилизации кальция. Селективные по отношению к α1*, α7 и α9 подтипам nAChR нейротоксины стимулировали рост клеток в присутствии никотиновых агонистов в тестах резазуриновой колориметрии.

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

, 

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

, 

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

Цитотоксичность цитотоксинов/кардиотоксинов (ЦТ) змей определяется особыми остатками в трех петлях аминокислотной последовательности – новая классификация цитотоксинов

Цитотоксины/кардиотоксины (ЦТ) — это трех-петельные мембранно-активные токсины, присутствующие в ядах кобр. В зависимости от структуры трех петель эти токсины по-разному взаимодействуют с липидными мембранами. Анализ имеющихся аминокислотных последовательностей ЦТ, литературных и наших данных об их мембранной активности и конформационных равновесиях в водных растворах и мицеллах детергентов позволил нам идентифицировать «особые» аминокислотные остатки, которые мешают включению ЦТ в мембраны: это Pro9, Ser28 и Asn/Asp45 в пределах N-концевой, центральной и C-концевой петель соответственно. С учетом всех возможных комбинаций этих остатков, мы предложили разделить ЦТ на восемь групп. Группа 1 включает токсины, содержащие все вышеперечисленные остатки и проявляющие наименьшую мембранную активность. Группа 8 объединяет ЦТ, у которых эти остатки отсутствуют, и токсины этой группы проявляют наибольшую мембранную активность.

Для оценки влияния различных КТ на кардиомиоциты проводили измерение внутриклеточной концентрации Ca2+ методом флуоресценции и оценку формы кардиомиоцитов крысы. Наибольшая активность наблюдалась для кардиотоксина 2 кобры Naja oxiana (CT2No) из группы 8. Наименее активным оказался цитотоксин 1 кобры Naja haje (CT1Nh), относящийся к группе 1.

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

, 

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

, 

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

Рамановская спектроскопия позволила дифференцировать яды разных видов змей и выявила внутривидовые различия в составе ядов

Для оценки состава змеиных ядов мы предожили использовать спектроскопию комбинационного рассеяния света (КР). Метод не требует предварительной подготовки образцов, используемых в небольших количествах, что делает метод КР чрезвычайно привлекательным для исследования ядов. В данной работе проведены исследования КР ряда сухих ядов различных ядовитых змей. На основе полученных спектров КР с помощью математических методов понижения размерности и кластеризации проведена дифференциация ядов, отражающая их состав, а также отнесение змей, продуцирующих яд, к соответствующему семейству или даже роду. С помощью спектроскопии КР с анализом главных компонент мы также оценили вариации ядов индивидуальных экземпляров змей вида Vipera nikolskii из двух популяций и сравнили эти внутривидовые вариации с межвидовыми (по отношению к другим родственным видам). Установлено, что внутривидовые (меж- и внутрипопуляционные) различия в составе ядов меньше межвидовых. Для объяснения межпопуляционных различий методом КР проведен анализ состава ядов V. nikolskii из двух популяций.

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

, 

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

Выявлены структурные элементы αО-конотоксина GeXIVA, отвечающие за его сродство к «анальгетическому» подтипу α9α10 никотинового холинорецептора (нАХР)

В коллаборации с несколькими зарубежными лабораториями был осуществлен аспартат-сканирующий мутагенез и введение дополнительных мутаций в структуры двух дисульфидных изомеров αO-конотоксина GeXIVA, в результате чего били синтезированы 64 новых аналогов этого пептидного токсина, являющегося эффективным антагонистом α9α10 подтипа никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), вовлеченного в передачу болевых сигналов. Все аналоги были протестированы на функциональную активность в отношении данной мишени в электрофизиологических тестах, что позволило выявить ключевую роль аргининов в структуре GeXIVA, определяющих его высокое сродство и селективность по отношению к данному подтипу нАХР. Два аналога ([T1A,D14A,V28K]GeXIVA[1,2] и [D14A,I23A,V28K]GeXIVA[1,4]) показали исключительную селективность и суб-наномолярное сродство (0.79 и 0.38 нМ) к «анальгетическому» α9α10 нАХР.

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

, 

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

, 

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

, 

Лаборатория нейроиммунных процессов (Шелухина И.В.)

Эффективная, быстрая и недорогая экспрессия рецептор-связывающего домена S-белка SARS-CoV-2 вируса и ацетилхолин-связывающего белка из прудовика Lymnaea stagnalis в клетках лейшмании (LEXSY)

Нами был разработан протокол для эффективного, быстрого и недорогого получения биологически значимых гликозилированных белков (в том числе олигомерных) в системе экспрессии LEXSY клеток лейшмании, который был успешно применен для рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 и гомопентамерного ацетилхолин-связывающего белка (АХСБ) из прудовика Lymnaea stagnalis. Первый из них активно используется для получения антител против вируса и в научных исследованиях взаимодействия вируса с мишенями клеток-хозяев, а второй представляет собой структурную модель лиганд-связывающего домена всех подтипов никотиновых рецепторов. Оба продукта были получены в растворимой гликозилированной форме с выходами 1.5-2.0 мг/л культуры и чистотой не менее 95%, а их структурные и функциональные характеристики были не хуже ранее описанных.

Лаборатория оксилипинов (Безуглов В.В.)

, 

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

Новые механизмы комбинированного воздействия эндо- и параканнабиноидов на индукцию гибели раковых клеток

Эндоканнабиноиды анандамид (AEA) и 2-арахидоноилглицерол (2-AG) и параканнабиноид лизофосфатидилинозитол (LPI) играют важную роль в регуляции пролиферации раковых клеток. В то время как анандамид и 2-AG ингибируют пролиферацию раковых клеток, LPI известен как стимулятор рака. Несмотря на известное перекрестное взаимодействие эндоканнабиноидных рецепторов и одновременное присутствие в микроокружении рака обеих молекул, их комбинированная активность никогда не изучалась. Чтобы избежать ацильной миграции в 2-AG, мы синтезировали его новый аналог 2-арахидоноил-1,3-дифторпропанол (2-ADFP). Мы впервые оценили влияние LPI на активность AEA и 2-AG в шести линиях клеток рака молочной железы человека различной канцерогенности (MCF-10A, MCF-7, BT-474, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231). AEA оказывал как антипролиферативное, так и цитотоксическое действие с EC50 в диапазоне от 31 до 80 мкМ. LPIне оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток. В зависимости от линии клеток ответ на комбинацию LPI–AEA варьировался от снижения цитотоксичности AEA через активный рецептор GPR18 до её увеличения через рецептор CB2. Используя 2-ADFP, было показано, что 2-AGиндуцировал гибель клеток через индукцию COX-2, зависящую от CB2 и TRPV1, и продукцию окисленных метаболитов, в то время как LPI парадоксальным образом усиливал цитотоксичность.

Отдел биоинженерии

Лаборатория инженерии белка (Долгих Д.А.)

, 

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

Мутантный цитохром С как детектор генерации супероксида: влияние мутаций на функции и свойства

Сконструирована мутантная форма цитохрома с, утратившая функцию переносчика электронов в дыхательной цепи, но сохранившая структуру белка и способность к нейтрализации радикалов. Цитохром с с заменами поверхностных заряженных остатков практически неактивен по отношению к редокс-партнерам дыхательной цепи, однако сохраняет антиоксидантную активность по отношению к супероксиду. Увеличение пероксидазной активности мутантного цитохрома с связано с изменением его способности взаимодействовать с внешними лигандами. Направленные мутации вызвали смещение дипольного момента молекулы вследствие значительного изменения распределения зарядов на поверхности. Такой вариант цитохрома с может эффективно использоваться в качестве детектора супероксида в митохондриальных и других системах.

Лаборатория инженерии белка (Долгих Д.А.)

, 

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

Высокоаффинный флуоресцентный лиганд каналов Kv1 на основе агитоксина 2 с С-концевым положением eGFP

Получен генетически-кодируемый флуоресцентный лиганд на основе агитоксина 2, слитого на С-конце с eGFP (AgTx2-GFP). Электрофизиологические исследования на ооцитах показали способность AgTx2-GFP блокировать токи каналов Kv1.1, Kv1.3 и Kv1.6 с константами диссоциации (Kd) в низком наномолярном диапазоне, и канала Kv1.2 - в микромолярном диапазоне, что полностью соответствует активности природного агитоксина 2 на Kv1 каналах. Сравнение с активностью полученного ранее лиганда GFP-AgTx2, обладающего высокой избирательностью взаимодействия с каналом Kv1.3, показывает, что изменение положения флуоресцентного белка eGFP с N- на С-концевое существенно изменяет профиль аффинности генетически-кодируемого флуоресцентного лиганда (Ignatova A., et al. Cells, 2024, в печати). Продемонстрировано, что лиганд AgTx2-GFP может быть использован в качестве зонда для определения аффинности немеченых пептидных блокаторов к сайтам связывания каналов Kv1, а также для флуоресцентной визуализации мембранного распределения Kv1 каналов в клетках млекопитающих. Таким образом, лиганд AgTx2-GFP является одним из наиболее активных генетически-кодируемых флуоресцентных блокаторов каналов Kv1; он применим для целей скрининга лигандов и имиджинга каналов в клеточной мембране.

Работа выполнена в соавторстве с S.Peigneur и J. Tytgat, Левенский университет, Бельгия. Работа поддержана грантом РНФ 22-14-00406.

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

, 

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

Объяснена связь повышенной экспрессии генов LYPD6 и LYPD6B в мозге с расстройствами аутистического спектра

Дупликация хромосомного участка 2q23.q23.2, несущего гены LYPD6 и LYPD6B, приводит к снижению умственных способностей и развитию аутистических черт. Сотрудники лаборатории биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов ИБХ РАН совместно с коллегами из МГУ им. М.В. Ломоносова и Института медико-биологических проблем РАН исследовали в мышиной модели последствия повышенной экспрессии белков Lypd6 и Lypd6b (продуктов генов LYPD6 и LYPD6B) в мозге, характерной для пациентов с аутизмом и другими нейропсихиатрическими расстройствами. Двухнедельная внутримозговая инфузия рекомбинантных аналогов Lypd6 и Lypd6b ухудшила память и повысила острую тревожность у мышей, снизила плотность дендритных шипиков гиппокампа и миндалины, привела к гипоэкспрессии эндогенных Lypd6, Lypd6b и никотинового рецептора α7 в гиппокампе. Кроме того, в работе показано, что Lypd6b, как и Lypd6, является негативным аллостерическим модулятором никотиновых рецепторов. Работа поддержана Российским научным фондом.

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

, 

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

Водорастворимый Lynx1 повышает плотность дендритных шипиков и стимулирует астроцитарную сеть и сигнализацию

Ранее было показано, что водорастворимый аналог нейромодулятора человека Lynx1 обладает прокогнитивными свойствами, улучшающими память. В этой работе мы изучили механизмы, лежащие в основе действия Lynx1. Показано, что водорастворимый аналог Lynx1:

•потенциирует α7-nAChR в нейронах гиппокампа

•повышает плотность дендритных шипиков нейронов гиппокампа

•Впервые показано влияние Lynx1 на активность астроцитов:

усиление экспрессии молекул адгезии

регуляция секреции цитокинов

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

, 

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

, 

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

Роль трехпетельных белков морской звезды

Присутствие трехпетельных белков (TFP) в морских звездах было показано ранее, но их мишени и функциональная роль до сих пор остаются неизвестными. В этой работе мы проанализировали экспрессию, возможные мишени и функцию белка Lystar5 из морской звезды Asterias rubens.

•Гомологи Lystar5 обнаружены во всех классах иглокожих.

•Обнаружено несколько TFP морских звезд с высокой гомологией с TFP человека.

•Lystar5 экспрессируется на поверхности целомоцитов и клеток целомического эпителия, но не в стенке тела или кончике щупальца морской звезды.

•Lystar5 связывается с мембранной фракцией целомоцитов и целомического эпителия с наномолярной афинностью.

•Протеомный анализ предполагает, что интегрин α-8-подобный белок является мишенью Lystar5.

Отдел молекулярной нейробиологии

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

, 

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Отдел биомолекулярной химии (Ямпольский И.В.)

, 

Лаборатория биологических испытаний (Дьяченко И.А.)

Выделен и функционально охарактеризован селективный ингибитор ионного канала TRPV3 человека

Один из возможных способов борьбы с воспалениями кожного покрова, особенно с изнуряющим зудом состоит в коррекции активности канала TRPV3, широко распространенного в кератиноцитах. Из экстракта андрографиса метельчатого - лекарственного растения с противовоспалительными свойствами - был выделен селективный ингибитор TRPV3. С помощью Н- и С-ЯМР и масс-спектрометрии высокого разрешения соединение было идентифицировано как дитерпеноид лабданового типа, 14-дезокси-11,12-дидегидроандрографолид (ddA). Молекула проявила специфическую активность в тестах in vitro к каналу TRPV3 человека, стабильно экспрессированному в клетках CHO, и к эндогенному TRPV3 клеточной линии кератиноцитов HaCaT. Терапевтический потенциал молекулы был подтвержден в моделях зуда на мышах ICR. Дитерпеноид ddA подавляет зуд, вызванный активатором TRPV3 карвакролом, а также зуд, вызванный гистамином, с эффективностью, сравнимой с лоратадином, антигистаминным препаратом, применяемым в клинике.

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

Изменение активности каналов TRPV1 и TRPA1 пептидами морских анемон повышает жизнеспособность нейрональных клеток в модели болезни Паркинсона

Для моделирования болезни Паркинсона in vitro была модифицирована клеточная линия нейробластомы человека SH-SY5Y. Было показано, что клетки SH-SY5Y, дифференцированные до состояния дофаминергических нейронов с использованием ретиноидной кислоты и BDNF, могут успешно имитировать ранние и поздние стадии развития болезни Паркинсона, если они постоянно экспрессируют альфа-синуклеин или мутантный альфа-синуклеин A53T. Сверхэкспрессия альфа-синуклеина продемонстрировала нейропротекторный эффект и сопровождалась снижением экспрессии тирозингидроксилазы. Мутантный альфа-синуклеин A53T значительно повышал экспрессию проапоптотического белка BAX и делал клетки более восприимчивыми к апоптозу. Пептидные модуляторы ионных каналов TRPA1 и TRPV1, ранее выделенные из морских анемон, значительно снижали предрасположенность к апоптозу, при этом по-разному влияя на экспрессию генов белков, вовлеченных в апоптоз. Таким образом, было показано, что модуляторы TRPA1 и TRPV1 имеют потенциал для разработки новых терапевтических средств для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии (Василевский А.А.)

Биофизические механизмы, приводящие к миотонии, при мутации гена натриевого канала Nav1.4

Мы охарактеризовали эффект мутаций SCN4A, обнаруженных у пациентов с миотонией. Миотония — непроизвольный спазм мышц после их произвольного сокращения. Причиной миотонии могут быть мутации в гене SCN4A, который кодирует главную α-субъединицу потенциал-зависимого натриевого канала Nav1.4. Оказалось, что разные аминокислотные замены одного и того же остатка могут приводить к существенно различным эффектам на воротные механизмы канала: в одном случае (замена K1302Q) наблюдается ингибирование инактивации, в другом (K1302R) — облегчение активации. А некоторые замены (G1306E) приводят к обоим эффектам. При этом всегда наблюдается увеличение интервала значений мембранного потенциала, при которых натриевые каналы активны, что в конечном итоге и обусловливает симптомы миотонии.

Отдел молекулярной биологии и биотехнологии растений

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений (Тальянский М.Э.)

, 

Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений (Митюшкина Т.Ю.)

Поли АДФ рибозилирование у патогенного оомицета растений: ключевой регулятор роста и колонизации растения-хозяина

АДФ рибозилирование является обратимой модификацией белков и нуклеиновых кислот, контролирующей многие клеточные процессы, включая восстановление повреждений ДНК, пролиферацию и дифференцировку клеток, метаболизм, стресс и иммунитет у растений и животных. Участие АДФ рибозилирования в жизненном цикле Dictyostelium и некоторых нитевидных грибов было продемонстрировано. Однако роль этого процесса у патогенных оомицетов никогда не исследовалась. Мы показали, что геном Phytophthora infestans содержит два гена PARP-подобных белков и доказали наличие парилирующей активности у одного из них. Мы также продемонстрировали критическую функциональную роль АДФ рибозилирования для роста и развития Phytophthora

Лаборатория системного анализа белков и пептидов (Мамаева А.С.)

, 

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

Пептидом растений - сложная и многокомпонентная система поддержания баланса «рост-стрессовый ответ»

Пептиды выполняют важную роль в качестве медиаторов процессов роста и развития растений, а также регулируют ответ на стрессовые факторы. Мы показали, что недостаток влаги приводит к изменению секретируемых пептидных пулов у пшеницы, что может играть существенную роль в адаптации растений к данному типу стресса. Мы выявили 2294 пептида в секретоме корней пшеницы в условиях засухи, среди которых были представители малых секретируемых пептидов (SSP). Помимо этого проведён анализ действия регуляторных пептидов EPFL (EPIDERMAL PATTERNING FACTOR LIKE) и PSY(L) (Plant Peptides Containing Sulfated Tyrosine Like) у модельного растения Physcomitrium patens на клеточном уровне. Показано, что EPFL индуцирует продукцию АФК, что может указывать на его роль в иммунном ответе. При этом пептиды PSY и PSYL1/2 стимулировали ростовые реакции - рост протонемы, удлинение клеток и образование гаметофоров. Таким образом, регуляторные пептиды - важный компонент системы контроля баланса между ростовыми процессами и защитными реакциями.

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений (Долгов С.В.)

Мультиплексное редактирование системами CRISR/CAS9 генов тритикале отвечающих за состав крахмала в семенах

Цель исследований – применить методы CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома для получения перспективных линий зерновых культур с рядом новых мутаций, обеспечивающими изменение состава и качества крахмала в зерне, на примере тритикале (× Triticosecale). Разработана технология, которая позволяет достичь одновременного редактирования четырех генов гексаплоидной тритикале путем целенаправленного воздействия системами CRISPR/Cas9 на нуклеотидные последовательности генетических участков трех субгеномов AA, BB и RR. Получены растения, несущие нокауты по четырем генам одновременно. Работы по геномному редактированию тритикале выполнены впервые в мире.

Отдел химической биологии гликанов и липидов

Лаборатория углеводов (Бовин Н.В.)

Из крови лиц группы крови О системы АВО выделены неизвестные ранее анти-АВ антитела

Обнаружение новых антител в системе АВО – это как открытие новой планеты в Солнечной системе. Гематологи считают, что существуют анти-АВ антитела, то есть такие, что узнают оба антигена (А и В, тетрасахариды показаны на слайде), но выделить такие антитела не представлялось возможным. В лаборатории углеводов придумали, как это сделать. Сайтом различия антигенов А и В является всего лишь участок -NHAc, антитела дискриминирующие антигены А и В обязаны его узнавать. Трюк дизайна состоял в том, чтобы привязать тетрасахарид к носителю (сефарозе) именно по этому сайту, чтобы обычные (классические) анти-А и анти-В не имели стерической возможности для взаимодействия, но в то же время участок одинаковый для антигенов А и В оказывался выгодно экспонированным (см. рисунок). Аффинная хроматография с помощью этого сорбента дала антитела с искомой АВ-специфичностью, то есть они одинаково хорошо агглютинировали эритроциты групп крови А и В. Локализация предсказанного эпитопа подтверждена с помощью STD-ЯМР комплекса синтетического антигена с выделенными антителами. Важно, что в крови лиц группы крови О таких антител примерно столько же, сколько анти-А или анти-В, то есть это реально важный «игрок» при переливании крови.

Лаборатория углеводов (Бовин Н.В.)

Гликом клеточных микровезикул существенно отличается от гликома материнских клеток

Микровезикулы (МВ) образуются из плазматической мембраны клетки, поэтому гликом МВ ожидался: 1)идентичным материнской клетке при стохастическом формировании МВ, или 2)измененным при условии формирования МВ из специфических участков мембраны. С помощью лектинового эррея показано, что гликом МВ полученных из эндотелиальных клеток, заметно беднее гликома клетки материнской мембраны, в частности, в нем отсутствуют 1,2-фукозилированные и 2,3-сиалилированные гликаны, а также маннозо-богатые цепи. Таким образом, реализуется второй сценарий. Эта информация станет ключевой в дальнейшем изучении трафикинга МВ к клеткам крови, опосредованного взаимодействием гликанов МВ с одной стороны, и лектинов клеток-адресатов – с другой

Лаборатория химии липидов (Водовозова Е.Л.)

, 

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Межмолекулярные взаимодействия фосфатных групп липидов

Анионный фосфолипид фосфатидилглицерин – важный компонент биологических мембран и систем доставки лекарств на основе липидов. В его композициях с фосфатидилхолином обнаруживаются нелинейные свойства, которые обычно связывают с сегрегацией этих липидов. С помощью комбинации методов флуоресцентной и ИК-спектроскопии с методами квантовой химии и молекулярной динамики нами показано, что нелинейность обусловлена образованием водородных связей между молекулами фосфатидиглицерина. Атомы кислорода фосфатной группы последнего менее экранированы, по сравнению с фосфатными кислородами фосфатидилхолина. Это явление необходимо учитывать как при исследовании взаимодействий белков с липидным мембранами с помощью молекулярных зондов, так и при разработке липидных формуляций для наномедицины.

Отдел биомолекулярной химии

Отдел биомолекулярной химии (Ямпольский И.В.)

, 

Лаборатория химии метаболических путей (Ямпольский И.В.)

, 

Лаборатория рационального дизайна химиотерапевтических агентов (Осипова (Каськова) З.М.)

, 

Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений (Митюшкина Т.Ю.)

, 

Лаборатория оптического биоимиджинга (Мишин А.С.)

, 

Группа биотехнологии растений (Захарченко Н.С.)

, 

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Гибридный путь автономной биолюминесценции

Мы выявили альтернативные, более компактные гиспидинсинтазы – поликетидсинтазы III типа, способные катализировать превращение кофейной кислоты в гиспидин – предшественник люциферина грибов. Замена гиспидинсинтазы грибов nnHispS на поликетидсинтазы растений позволила компактизировать кодирующую последовательность гиспидинсинтазы примерно в 4 раза и избавила от необходимости внесения дополнительного фермента для ее посттрансляционной модификации.

Было показано, что такой гибридный путь может обеспечивать автономную биолюминесценцию у дрожжей, млекопитающих и растений. Благодаря более компактным гиспидинсинтазам растений появляются дополнительные методы доставки генов автолюминесценции с помощью вирусных векторов.

Отдел биомолекулярной химии (Ямпольский И.В.)

, 

Лаборатория химии метаболических путей (Ямпольский И.В.)

, 

Лаборатория рационального дизайна химиотерапевтических агентов (Осипова (Каськова) З.М.)

, 

Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений (Митюшкина Т.Ю.)

, 

Лаборатория оптического биоимиджинга (Мишин А.С.)

, 

Группа биотехнологии растений (Захарченко Н.С.)

Улучшенный способ имиджинга автономной биолюминесценции у эукариот

Открытие метаболического пути биолюминесценции у гриба Neonothopanus nambi позволило создать эукариоты с автономной биолюминесценцией. Однако яркость люминесценции в гетерологических системах была ограничена работой нативных ферментов. Нами была проведена оптимизация метаболического пути, которая позволила повысить яркость биолюминесценции на 1-2 порядка у растений, дрожжей, млекопитающих.

Отдел биоматериалов и бионанотехнологий

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

Выявлены морфологические параметры, позволяющие достоверно определять состояние астороцитов в норме и при патологии

С использованием оптико-зондовой нанотомографии разработан метод реконструкции 3-D изображений астроцитов с высоким разрешением в норме и при патологии. Выявлены морфологические параметры, демонстрирующие статистически достоверные различия: отношения площади поверхности астроцитов к объему и их фрактальная размерность. Оба параметра достоверно больше для образцов, полученных в модели болезни Альцгеймера на досимптоматической стадии (норма), что свидетельствует о большей сложности поверхности и развитости ветвления отростков астроцитов по сравнению с болезнью Альцгеймера на симптоматической стадии (патология). Совокупность данных параметров можно использовать в качестве критерия оценки патологических изменений отростков астроцитов в модели болезни Альцгеймера.

Необходимо подчеркнуть уникальность метода: оценка трехмерных морфологических параметров астроцитов стандартными методами конфокальной микроскопии, ограниченными дифракционным пределом, не позволяет получить статистически достоверных различий.

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

Разработаны молекулярные модели наночастиц для таргетной доставки гидрофобных лекарств

Разработаны молекулярные модели органических наночастиц с гидрофобным ядром из липидов и гидрофильной оболочкой из спейсеров, модифицированных биотином или циклодекстрином. Выявлены эффекты плотности оболочки и лигандов, определены оптимальные условия презентации функциональной части на поверхности наночастиц, то важно при создании наносистем таргетной доставки. Получены топографические карты поверхности наночастиц, приводящие к более глубокому пониманию процесса образования биомолекулярной короны. Полученные выводы подтверждены экспериментальными данными, такими как атомно-силовая микроскопия, динамическое рассеяние света, малоугловое рентгеновское рассеяние.

На рисунке слева сопоставление данных моделирования и результатов малоуглового рентгеновского рассеяния. Справа – топография поверхности наночастиц, выделены фрагменты, презентирующие функциональные группы. Результаты позволяют оценить не только статические свойства наночастиц (толщина оболочки, неоднородность покрытия) но и динамические параметры в физиологических условиях.

Лаборатория полимеров для биологии (Генералова А.Н.)

, 

Отдел биоматериалов и бионанотехнологий (Олейников В.А.)

Полимер-модифицированные магнитные углеродные нанотрубки для обратимой сорбции ДНК.

Преложен способ модификации магнитных многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) поликатионами. Разработанные материалы обратимо удерживают ДНК, чистота и количественный выход десорбированнной ДНК обеспечивают эффектинвый ПЦР-анализ.

Полученные на основе российских МУНТ сорбенты перспективны в качестве альтернативы коммерческим магнитным частицам, например, в криминалистике для сохранения и архивирования генетического материала.

Лаборатория биомедицинских материалов (Марквичева Е.А.)

Загруженные гидроксиапатитом макропористые гидрогели : получение, характеризация и изучение in vitro стые гидрогели : получение и

Макропористые Са-альгинатные гидрогели, загруженные наночастицами гидроксиапатита, были получены из замороженных водных растворов и охарактеризованы. Были изучены набухаемость и механические свойства (модуль Юнга) гидрогелей в зависимости от содержания гидроксиапатита (5-30 масс %). Локализацию клеток в макропорах гидрогелей, а также их поведение (адгезия, распластывание) изучали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, а рост и пролиферацию мышиных фибробластов (L929) количественно оценивали с помощью МТТ-теста после длительного культивирования в течение 7 дней. Макропористые Са-альгинатные гидрогели, содержащие наночастицы гидроксиапатита, являются перспективными матриксами для тканевой инженерии.

Лаборатория иммунохимии (Бровко Ф.А.)

Разработка и валидация мультиплексного иммуноферментного анализа на основе микросфер для одновременного обнаружения пятнадцати патогенных биологических агентов

В этом исследовании был разработан мультиплексный сэндвич-иммуноферментный анализ (MIA) на основе микросфер для одновременного обнаружения пятнадцати растительных и бактериальных (грамположительных и грамотрицательных) патогенных биологических агентов (ПБА). Это исследование включало разработку: детектирующих «сэндвич»-пар моноклональных антител; аналитического протокола; оценку специфичности и чувствительности детекции. Были оценены рабочий диапазон, линейность, точность и пределы обнаружения разработанного анализа. LLOQ (нижний предел количественного определения) мультиплексного анализа составил около 104 – 105 КОЕ/мл для бактерий и 0,4 нг/мл – 6,6 нг/мл для антигенов. Анализ можно использовать для одновременного обнаружения 15 ПБА, включая Francisella tularensis, Brucella abortus, Bacillus anthracis, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhimurium, а также бета-субъединицу холерного токсина, вискумин, рицин, стафилококковые энтеротоксины А и В и ботулинические токсины А и В.

Группа молекулярной экологии (Трубецкая О.Е.)

Влияние фактора времени на пути трансформации природных гуминовых веществ: формирование везикулярных или плоских ленточныхпластинчатых нано- или микроструктур

Настоящее исследование посвящено изучению структуры и функции гуминовых веществ (ГВ), которые являются практически неисчерпаемым и недорогим природным источником наноматериалов - углеродных точек, имеющих целый ряд преимуществ по сравнению с квантовыми точками для их применения в медицине. С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с негативным контрастированием препаратов уранилацетом была впервые исследована временная динамика формирования нано- и микроструктур почвенных ГВ в зависимости от химического состава препаратов. Впервые обнаружено, что везикулоподобные наноструктуры ГВ, формируются с течением времени и при определенном соотношении ароматических и алифатических низкомолекулярных компонентов. В случае избытка ароматических соединений в растворе ГВ, образуются микроструктуры типа ленточных или пластинчатых агрегатов. Обнаруженные закономерности впервые визуально демонстрируют формирование супрамолекулярных нано- и микрокомплексов природных ГВ.

Отдел геномики адаптивного иммунитета

Отдел геномики адаптивного иммунитета (Чудаков Д.М.)

TCRen: метод ранжирования потенциальных пептидных эпитопов для данного TCR

Предсказание специфичности Т-клеточных рецепторов in silico является одной из важнейших задач современной биоинформатики.

Пайплайн TCRen включает:
1) Моделирование структуры TCR–pMHC для данного MHC.
2) Извлечение карты контактов остатков TCR–пептид.
3) Карта контактов используется для ранжирования всех потенциальных эпитопов на основе оценки взаимодействия с целевым TCR. Оценка выполняется с использованием энергетического потенциала, полученного из статистики предпочтений контактов TCR–пептид в известных кристаллических структурах.

TCRen обладает высокой эффективностью в различении распознаваемых пептидов и может существенно облегчить идентификацию распознаваемых опухолевых неоантигенов.

Лаборатория сравнительной и функциональной геномики (Лебедев Ю.Б.)

, 

Группа алгоритмов иммуносеквенирования (Шугай М.А.)

Метод количественного анализа динамики репертуара Т-лимфоцитов

Долговременный мониторинг клонального репертуара Т-лимфоцитов может дать ценную информацию об изменениях иммуностатуса онкопациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) или здоровых доноров после вакцинации. В этой работе мы предлагаем новый биоинформатический метод количественной оценки динамики репертуара Т-лимфоцитов на основе данных секвенирования Т-клеточных рецепторов (ТКР). Информативность метода продемонстрирована на примерах а) изучения стабильности репертуара ТКР у здоровых доноров, б) количественной оценки эффекта инфузии донорских лимфоцитов и судьбы различных субпопуляций Т-клеток у пациентов с ТГСК и в) определения экспансии патоген-специфических клонов у вакцинированных лиц.

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

, 

Отдел функционирования живых систем (Донцова О.А.)

Румицидины – новое семейство защитных пептидов млекопитающих, блокирующих выходной тоннель 70S рибосом

Биоинформатический поиск и анализ биоразнообразия кателицидинов млекопитающих позволил обнаружить новое уникальное семейство пролин-богатых антимикробных пептидов (ПБ-АМП), гены которых распространены среди жвачных парнокопытных. Благодаря множественным контактам пептида в выходном тоннеле и пептидилтрансферазном центре рибосомы, румицидины способны эффективно ингибировать стадию элонгации трансляции у бактерий. Ключевой структурной особенностью румицидинов является наличие консервативной диады Trp23-Phe24, которая образует ряд ключевых взаимодействий с 50S субъединицей в области сужения выходного тоннеля. Румицидины обладают высокой активностью против микобактерий и ряда важных грамотрицательных бактерий, относящихся к так называемым «ESKAPE»-патогенам. Их эффективность как антибиотиков была также доказана на модели летальной септицемии у мышей, вызванной E. coli.

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

Новые структурные семейства танатин-подобных антимикробных пептидов насекомых, эффективных против клинически значимых бактериальных патогенов

Биоинформатический поиск в базах данных транскриптомов насекомых позволил обнаружить новые семейства β-шпилечных защитных АМП у представителей подотряда клопов (Heteroptera). Пептид Rip-2 способен эффективно подавлять рост энтеробактерий in vitro и in vivo (в суточной дозе не менее 5 мг/кг у мышей), благодаря эффективному связыванию с липополисахаридом и белком LptA, необходимым для биогенеза внешней мембраны бактерий. Напротив, пептиды Rip-3 и Rip-4 способны нарушать мембраны широкого спектра бактерий, причём наибольшая специфичность действия наблюдается в отношении грамположительных бактерий родов Bacillus и Mycobacterium.

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

Ацидоцин А и ацидоцин 8912 принадлежат к отдельному подсемейству бактериоцинов II класса с широким спектром антимикробной активности

Среди бактериоцинов IIa подкласса идентифицировано подсемейство антимикробных пептидов, обладающих широким спектром антимикробной активности. Эти пептиды структурно родственны классическим педиоцин-подобным бактериоцинам, однако существенно отличаются от них спектром активности и механизмом антимикробного действия. Представителями подсемейства являются ацидоцин А, ацидоцин 8912 и бактериоцин OR-7 из разных штаммов лактобацилл. При анализе структуры плазмид молочнокислых бактерий нами обнаружен ещё один предполагаемый представитель данного подсемейства. Пептиды демонстрируют склонность к формированию амфифильной α-спиральной структуры, необратимо повышают проницаемость мембран микроорганизмов, но характеризуются умеренной цитотоксичностью в отношении клеток человека. В отличие от других представителей подкласса, антибактериальная активность не зависит от наличия «педиоцинового бокса» в N-концевой части молекулы. Пептиды активны в отношении антибиотикорезистентных клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida. Исследована протеолитическая стабильность ацидоцина A в условиях, имитирующих условия в пищеварительном тракте, а также показана его способность проникать через кишечный эпителий на модели монослоя клеток CaCo-2.

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

Структурные и иммунологические особенности аллергенов PR-10 на примере основного аллергена пыльцы ольхи Aln g 1

Aln g 1 — клинически значимый, но недостаточно изученный аллерген пыльцы ольхи. Он принимает участие в развитии аллергических перекрестных реакций с основным аллергеном класса PR-10 — пыльцой березы Bet v 1. Aln g 1 способен вызывать Bet v 1-независимую сенсибилизацию иммунной системы, что может быть причиной неэффективности АСИТ, проводимой с Bet v 1. Исследование показало, что Aln g 1 стимулирует алармины, связывается с гидрофобными лигандами и не полностью восстанавливает структуру после нагревания, теряя IgE-связывающую активность. Замена двух остатков, Asp27 и Leu30, расположенных у входа в гидрофобную полость Aln g 1, нарушает структуру аллергена и снижает его способность связывать IgE сывороток больных аллергией и липидные лиганды. Показано, что термообработанный Aln g 1 и его мутант D27A/L30A – потенциальные гипоаллергенные варианты для АСИТ.

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

Растительные дефенсины - перспективные противогрибковые агенты с иммуномодулирующим действием

Дефенсин табака NaD1 проявляет эффективное фунгицидное действие против чувствительных и резистентных к азолам и эхинокандинам штаммам Candida albicans, обладает способностью ингибировать адгезию клеток гриба, предотвращает образование биопленок и усиливает действие каспофунгина.

Показано, что NaD1 оказывает иммуномодулирующее действие на различные иммунные клетки. В частности, NaD1 действовует на покоящиеся и стимулированные бактериальными или грибковыми PAMP THP-1 макрофаги, влияя на выработку ключевых цитокинов острой фазы воспаления.

Высказано предположение о том, что иммуномодулирующая активность, а также способность NaD1 действовать в синергизме с такими эндогенными AМП, как LL-37 и HBD2, могут способствовать эффективности этого пептида в условиях инфекции in vivo.

Отдел функционирования живых систем

Отдел функционирования живых систем (Донцова О.А.)

Определение мест посадки трансляционных комплексов позволяет отличить проскальзывающее сканирование от ре-инициации трансляции матриц, контролируемых расположенными в 5’UTR рамками считывания

Разработан биоинформатический подход для изучения регуляции трансляции с помощью коротких открытых рамок считывания (кОРС) в 5’НТО мРНК млекопитающих. Показано, что анализ данных рибосомного профилирования сканирующих комплексов (TCP-seq) позволяет установить вклад проскальзывающего сканирования и реинициации в кОРС-опосредованную регуляцию трансляции. Разработанный подход может быть использован для изучения трансляции и поиска новых протеоформ у человека.

Отдел функционирования живых систем (Донцова О.А.)

Индуцированная терапией секреция компонентов сплайсосмы индуцирует взаимодействие между клетками рака яичников, способствующие их выживанию

Рак яичников часто устойчив к традиционным методам лечения, снижая их эффективность. В данной работе показано, что молекулы, секретируемые клетками рака яичников после терапии, способствуют устойчивости к цисплатину и усиливают восстановление повреждений ДНК в раковых клетках-реципиентах. Обнаружено, что ex vivo и in vitro клетки рака яичников при обработке химиопрепаратами секретируют широкий спектр белков и нуклеиновых кислот, в котором много компонентов сплайсосом, которые вносят существенный вклад в фенотипические эффекты, которые эти секретомы.оказывают на клетки. Так, сплайсосомальные белки SNU13 и SYNCRIP способствуют устойчивости к терапии, а экзогенные мяРНК U12 и U6atac стимулируют рост опухоли. Эти результаты демонстрируют, что внеклеточная сигнализация может быть ключевым фактором, способствующим возникновению резистентности рака яичников к терапии.

Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О.А.)

, 

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Шахпаронов М.И.)

Индуцированная терапией секреция компонентов сплайсосмы индуцирует взаимодействие между клетками рака яичников, способствующие их выживанию

Рак яичников часто устойчив к традиционным методам лечения, снижая их эффективность. В данной работе показано, что молекулы, секретируемые клетками рака яичников после терапии, способствуют устойчивости к цисплатину и усиливают восстановление повреждений ДНК в раковых клетках-реципиентах. Обнаружено, что ex vivo и in vitro клетки рака яичников при обработке химиопрепаратами секретируют широкий спектр белков и нуклеиновых кислот, в котором много компонентов сплайсосом, которые вносят существенный вклад в фенотипические эффекты, которые эти секретомы.оказывают на клетки. Так, сплайсосомальные белки SNU13 и SYNCRIP способствуют устойчивости к терапии, а экзогенные мяРНК U12 и U6atac стимулируют рост опухоли. Эти результаты демонстрируют, что внеклеточная сигнализация может быть ключевым фактором, способствующим возникновению резистентности рака яичников к терапии.

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

, 

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

, 

Лаборатория антибиотикорезистентности (Терехов С.С.)

, 

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

, 

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

, 

Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О.А.)

, 

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

Гауземицины C,D,E,F: структура, спектр активности, механизм действия

Установлено строение минорных компонентов пептидного антибиотического комплекса гауземицина, гауземицинов C,D,E,F, и исследован спектр и механизм их антибиотической активности. Соединения проявляют выраженную зависимость от концентрации ионов кальция. Алкилирование боковой группы орнитина и дегликозилирование приводят к снижению антимикробной активности. Исследование взаимодейтсвия с модельными мембранами выявило стабилизацию конформации молекулы в липидном бислое.

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

Флуоресценция красителей BODIPY в газовой фазе

Молекулярная флуоресценция – явление, которое обычно наблюдается в конденсированной фазе. На неё сильно влияют молекулярные взаимодействия. Изучение спектров флуоресценции в газовой фазе может служить практически идеальной моделью для оценки внутренних свойств флуорофоров. К сожалению, большинство обычных флуорофоров недостаточно летучи, чтобы можно было изучать их флуоресценцию в газовой фазе. Мы обнаружили яркую газофазную флуоресценцию простых красителей BODIPY, наблюдаемую при атмосферном давлении (на картинке: флуоресценция 3,5-диметил-BODIPY и 8-метокси-BODIPY).

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

, 

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

, 

Лаборатория антибиотикорезистентности (Терехов С.С.)

, 

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Исследование влияния длины линкера на активность in vitro гомогенного конъюгата антитела с препаратом

Гомогенные конъюгаты антител с препаратами (ADC, antibody-drug conjugates) демонстрируют лучшие фармакологические свойства по сравнению с классическими гетерогенными аналогами, на текущий момент одобренными к применению на пациентах. Сайт-специфичная конъюгация полезной нагрузки с антителом, необходимая для обеспечения гомогенности, может быть осуществлена с помощью ферментов, например, микробной трансглутаминазы (MTGase). С ее помощью на одну молекулу антитела можно ввести две модификации, а для достижения более высокой терапевтической нагрузки необходимо использовать разветвленные линкеры. В настоящее время имеется мало информации о связи между структурой разветвленного линкера и свойствами ADC.

Для конъюгации с помощью фермента мы получили два разветвленных амино-триазидных линкера, отличающихся фрагментом PEG4 после точки разветвления. На основе этих линкеров далее были получены два гомогенных ADC на основе антитела трастузумаб с терапевтической нагрузкой (drug-antibody ratio, DAR) 6 молекул препарата монометил ауристатина Е (ММАЕ). Для свободного высвобождения препарата в опухолевой клетке в структуру был также введен расщепляемый катепсином В линкер. В качестве контроля использовали два других конъюгата трастузумаб-ММАЕ: гетерогенный ADC с DAR 6, полученный с помощью обычной тиол-малеимидной химии, и гомогенный ADC с DAR 2. Было обнаружено, что, хотя все четыре конъюгата имели одинаковое сродство к HER2, их цитотоксичность существенно различалась: «длинный» гомогенный ADC с DAR 6 был так же активен, как и его гетерогенный аналог, а «короткий» ADC с DAR 6 был на порядок менее эффективен, уступая даже конъюгату с нагрузкой 2. Наши результаты показывают, что длина разветвленного линкера оказывает решающее влияние на цитотоксическую активность ADC, вероятно, из-за стерических препятствий, влияющих на скорость расщепления линкера лизосомальными ферментами.

Лаборатория молекулярной вирусологии (Рубцов Ю.П.)

Завершение второго мейотического деления у MII ооцитов мыши коррелирует с распределением фибриллярного актина и митохондрий в ооплазме

Филаменты актина играют значительную роль в процессе созревания ооцитов и завершении мейоза. Однако до сих пор остается неясным, как локализация фибриллярного актина ассоциирована с нормальным завершением второго мейотического деления. Распределение митохондрий является другим важным параметром, коррелирующим со способностью MII ооцитов заканчивать мейоз. Объектом нашего исследования являлось изучение роли актиновых филаментов в распределении митохондрий и, соответственно, в мейотической компетенции MII ооцитов. Мы показываем, что при ингибировании полимеризации актина посредством моноклональных антител в молодых ооцитах мыши наблюдается снижение количества F-актина и появление кластеров митохондрий, вызванное введением антител. Подобный фенотип наблюдался в ооцитах, состарившихся in vitro без дополнительной обработки. Наблюдаемые изменения коррелируют с пониженной способностью MII ооцитов к экструзии второго полярного тельца и формированию пронуклеуса. Изменения в колокализации F-актина и митохондрий, вероятно, являются результатом нарушения архитектуры цитоскелета. Изменения количества F-актина и его распределения в целом совпадают с перераспределением митохондрий. На основании полученных данных мы предполагаем, что микрофиламенты участвуют в перераспределении митохондрий во время старения in vitro. Соответственно, формирование расположения F-актина является индикатором высокой вероятности завершения второго деления мейоза. Эти результаты помогают в оценке качества ооцитов и выборе оптимального времени между помещением их в культуру и оплодотворением in vitro.

Лаборатория молекулярной вирусологии (Рубцов Ю.П.)

, 

Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О.А.)

Функциональное исследование роли белков человека RPF1 и ESF1 в процессинге пре-рРНК и сборке прерибосомных частиц

Биогенез рибосом – один из важнейших процессов, необходимых для функционирования клеток. У высших эукариот он представляет собой многоступенчатый строго контролируемый процесс, основанный на активности целого ряда специализированных белков и РНК. К белковым факторам, обеспечивающим созревание рибосомных субъединиц, относятся белки с разнообразными ферментативными (экзо-/эндонуклеазы, метилтрансферазы, хеликазы, протеинкиназы, АТФ/ГТФазы и т.д.) и структурными функциями. Некоторые гомологи человеческих белков в дрожжах S. cerevisiae, и об их функциях можно судить по структурным и биохимическим данным, полученным для дрожжевых белков. Функции белков RPF1 и ESF1 в клетках человека остаются неизученными, хотя недавно было показано, что RPF1 участвует в биогенезе 60S. Оба белка участвуют в ранних стадиях биогенеза рибосом, которые изучены гораздо меньше, чем более поздние стадии. В данном исследовании мы осуществляли нокдаун белков RPF1 и ESF1 в клеточной линии HEK293T с помощью shRNA/siRNA, чтобы определить их роль биогенезе рибосом. Снижение содержания RPF1 и ESF1 значительно изменило профиль предшественников рибосомных РНК. Полученные результаты также свидетельствуют о том, что RPF1 и ESF1 связаны с разными прерибосомными частицами, пре-60S и пре-40S, соответственно. На основании полученных данных можно предположить, что оба фактора не участвуют непосредственно в расщеплении пре-рРНК, а скорее помогают пре-рРНК приобрести конформацию, благоприятствующую ее расщеплению.

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Шахпаронов М.И.)

, 

Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О.А.)

Нитрогруппа изменяет влияние производных пиридо[3,4-g]хиназолина на активность DYRK/CLK и сплайсинг РНК в клетках глиобластомы

Серин-треониновые протеинкиназы семейств DYRK и CLK фосфорилируют белки, участвующие в сплайсинге пре-мРНК, в связи с этим таргетинг сплайсинга с помощью ингибиторов DYRK/CLK стал перспективной противораковой стратегией. Мы продемонстрировали, что два структурно близких соединения по-разному ингибируют протеинкиназы DYRK1-4 и CLK1-3 in vitro. Последующий анализ транскриптома и протеома нейросфер глиобластомы, полученных от пациентов, обработанных соединением 2, показал, что это соединение нарушает взаимодействие CLK4 со сплайсосомальными белками, тем самым изменяя сплайсинг РНК. Важно отметить, что соединение 2 влияло на гены, экспрессия которых влияет на важные функции для раковых клеток. В целом эти результаты дают обоснование терапевтической эффективности соединения 2, продемонстрированной ранее в моделях глиобластомы in vivo.

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Шахпаронов М.И.)

, 

Лаборатория инженерии белка (Долгих Д.А.)

Сенсибилизация глиобластомы к терапевтическому воздействию лишения глютамина зависит от клеточного фенотипа и метаболизма

Совместно с лабораторией биоинженерии белка мы участвовали в исследовании влияния глутаминовой недостаточности на клеточный метаболизм и чувствительность клеток глиобластомы человека U87MG и T98G к препаратам различного происхождения.

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

, 

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Бочаров Э.В.)

, 

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

Диверсификация pH сенсоров на основе i-мотивов: схема мечения определяет внутриклеточную локализацию

Интеркалированные мотивы (иМ) представляют собой неканонические структуры ДНК и являются основой для разработки биосовместимых pH сенсоров. До настоящего времени изучены только pH сенсоры на основе последовательностей, складывающихся в иМ и меченных на 3'- и 5'-концах стандартными парами флуорофоров или парами флуорофор/тушитель для FRET/тушения при pH-зависимом складывании иМ. Сенсоры имели тенденцию накапливаться в ядрах клеток. Мы использовали цитозиновые миметики в качестве внутренних меток иМ и синтезировали новый нефлуоресцентный нуклеозидный аналог на основе феноксазина, tC^OAzo, который тушит флуоресценцию известного цитозинового миметика tCO. Включение пары tC^O/tC^OAzo в геномную последовательность C5T, формирующую иМ, привело к получению высококонтрастного pH сенсора с увеличенной точкой pH перехода и рабочим диапазоном, совместимым с физиологическими условиями. Важно отметить, что в отличие от известных ядерно-специфичных сенсоров на основе C5T со стандартными метками, которые обеспечивают флуоресцентный сигнал в зеленом/красном каналах, новый сенсор локализовался в основном в цитоплазме и позволял осуществлять отслеживание pH на основе сигнала tC^O в синем канале. Поскольку схема мечения была единственной особенностью нового сенсора, она, по всей видимости, определяет уникальный паттерн распределения, т. е. накопление сенсора в цитоплазме. Результаты подчеркивают важность схемы мечения pH сенсоров на основе иМ и открывают путь для мультиплексного отслеживания pH в различных клеточных компартментах.

Группа химии природных соединений (Михайлов А.А.)

, 

Лаборатория химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Соединения ингибирующие ВИЧ-1 за счет подавления постинтеграционной ДНК репарации

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и ВИЧ-инфекция, им вызываемая, представляют глобальную угрозу. Несмотря на наличие успешной антиретровирусной терапии, высокая изменчивость вируса делает необходимой разработку альтернативных методов воздействия на ВИЧ. Коллегами из Института Белозерского МГУ активно изучается взаимодействие ВИЧ с белками клетки-носителя. Ими было найдено, что ключевую роль в устранении двуцепочечных разрывов, связанных с интеграцией вирусной ДНК, играет гетеродимерный белок Ku70/Ku80. Ингибирование взаимодействия вирусной интегразы с белковым комплексом позволяет остановить репликацию вируса.

Нами совместно с коллегами было проведено исследование структура-зависимость ингибиторов пост-интеграционной репарации, найдены перспективные классы соединений.

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Изучение механизмов регуляции трансляции при помощи коротких открытых рамок считывания

Короткие открытые рамки считывания в 5’нетранслируемых областях мРНК млекопитающих являются наиболее распространенными элементами, регулирующими белковый синтез. Однако механизмы регуляции трансляции с помощью таких элементов остаются невыясненными. Нами разработан биоинформатический подход для изучения регуляции трансляции с помощью коротких открытых рамок считывания (кОРС) в 5’НТО мРНК млекопитающих. Показано, что анализ данных рибосомного профилирования сканирующих комплексов (TCP-seq) позволяет установить вклад проскальзывающего сканирования и реинициации в кОРС-опосредованную регуляцию трансляции. Разработанный подход может быть использован для изучения трансляции и поиска новых протеоформ у человека.

На рисунке показано схематическое описание предложенного биоинформатического подхода. Для индивидуальной кОРС оценивается интенсивность сигнала от сканирующих рибосом перед, внутри и после кОРС, в результате чего можно оценить вклад проскальзывающего сканирования и реинициации в регуляцию трансляции.

Отдел метаболизма и редокс-биологии

Группа редокс-биологии (Подгорный О.В.)

, 

Отдел метаболизма и редокс-биологии (Белоусов В.В.)

, 

Лаборатория молекулярных технологий (Белоусов В.В.)

Канал TRPV1 человека как термогенетический инструмент для хронической нейромодуляции

Методические подходы, обеспечивающие дистанционную и минимально инвазивную нейромодуляцию, востребованы не только в фундаментальных исследованиях функций мозга, но и являются перспективными инструментами для терапии некоторых заболеваний центральной нервной системы. Опто- и хемогенетика, которые сделали революцию в исследованиях функционирования мозга, пока не нашли широкого применения в медицине. Оптогенетика использует ионные каналы и насосы из растений и архей, что ограничивает ее использование в медицине из-за возможного иммунного ответа организма человека на чужеродные белки. Хемогенетика не может обеспечить быструю динамику нейромодуляции.

• Здесь мы впервые показываем, что термочувствительный канал TRPV1 человека может быть использован в качестве термогенетического инструмента для управления активностью нервных клеток у млекопитающих.
• Термостимуляция нейронов локомоторного отдела среднего мозга, в которых экспрессирован TRPV1 человека, с помощью инфракрасного лазера через имплантированный оптоволоконный интерфейс вызывает значительное увеличение двигательной активности у бодрствующих свободно подвижных мышей.
• Наблюдаемые эффекты на поведение животных достигаются при нагревах в безопасном диапазоне температур.
• Продемонстрированное впервые в нашей работе применение термогенетики на основе канала TRPV1 человека для хронической нейромодуляции делает эту технологию потенциально транслируемой в медицину.

Группа метаболических основ патологии (Билан Д.С.)

, 

Отдел метаболизма и редокс-биологии (Белоусов В.В.)

Генетически кодируемые биосенсоры на основе cpYFP в многофотонном режиме возбуждения флуоресценции

Улучшений визуализации флуоресцентного сигнала генетически кодируемых биосенсоров с высоким пространственно-временным разрешением в сложных биологических системах in vivo можно достигать как путем усовершенствования свойств самих биосенсоров, например, увеличивая их яркость, так и усовершенствованием подходов регистрации сигнала. Совместно с коллегами из лаборатории фотоники и нелинейной спектроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова в многофотонном режиме возбуждения флуоресценции были детально охарактеризованы спектральные свойства некоторых рациометрических биосенсоров на основе cpYFP.

Группа метаболических основ патологии (Билан Д.С.)

, 

Группа редокс-нейробиологии (Браже Н.А.)

, 

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

, 

Отдел метаболизма и редокс-биологии (Белоусов В.В.)

Исследование динамики генерации пероксида водорода (Н2О2) в различных тканях Danio rerio в условиях гипоксии

Недостаток кислорода (O2) вызывает изменения в функционировании клеток. Моделирование гипоксии в системах in vitro представляет сложную задачу, поскольку разные типы клеток проявляют разную чувствительность к уровням O2 в тканях. Мы разработали эффективную платформу для in vivo оценки различных параметров тканей Danio rerio в условиях острой гипоксии. Система позволяет одновременно размещать несколько особей в камере, в которой точно и быстро регулируется уровень O2 в воде при одновременном проведении микроскопии. Мы применили этот подход в комбинации с генетически кодируемым pH-биосенсором SypHer3s и высокочувствительным к H2O2 биосенсором HyPer7. Гипоксия вызывает генерацию H2O2 в областях мозга, сердца и скелетных мышц, при этом исключительно в митохондриальном матриксе выбранных типов клеток; примечательно, что H2O2 не проникает в цитозоль и нейтрализуется в митохондриях при реоксигенации. Гипоксия вызывает выраженный ацидоз тканей, который выражается в повсеместном снижении рН на 0,4-0,6 единицы. Применив этот подход с использованием генетически кодируемых биосенсоров в сочетании с фотоплетизмографией и Рамановской микроспектрометрией, мы получили in vivo карту событий, отражающих состояние тканей в изменяющихся условиях O2.

Отдел биотехнологии

Отдел биотехнологии (Мирошников А.И.)

, 

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

, 

Лаборатория биофармацевтических технологий (Есипов Р.С.)

Особенности ферментативного трансгликозилирования в синтезе нуклеозидов 8-аза-7-деазапуринового флексимера рекомбинантным PNP E. coli: синтез и определение структуры минорных продуктов

Ферментативное трансгликозилирование флексимерного основания 4-(4-аминопиридин-3-ил)-1H-пиразола с использованием рекомбинантной пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP) E. coli привело к образованию «нетипичных» минорных продуктов реакции. В дополнение к нормальному N1-пиразольному нуклеозиду были получены 4-иминопиридиновый рибозид и бис-рибозид. Была выяснена роль термодинамических параметров ключевых интермедиатов в образовании продуктов реакции. Для определения механизма связывания и активации гетероциклического субстрата в активном центре PNP E. coli было проведено молекулярное моделирование основания флексимера и продуктов реакции в активном центре фермента. Что касается N1-пиридинового рибозида, то для него существует два возможных расположения в активном центре PNP. Наличие относительно большого пространства в области аминокислотных остатков Phe159, Val178 и Asp204 позволяет остатку рибозы вписаться в это пространство, а гетероциклическому основанию занять положение, удобное для вторичного гликозилирования. Возможно, именно такое «перевернутое» расположение способствует быстрому образованию минорных бис-рибозидов в активном центре фермента.

Лаборатория биофармацевтических технологий (Есипов Р.С.)

, 

Лаборатория биосинтеза низкомолекулярных физиологически активных соединений (Константинова И.Д.)

Рациональный дизайн высокоэффективного биокатализатора для фосфорибозилирования противовирусных производных пиразин-2-карбоксамида

Противовирусные препараты T-1105 (3-гидроксипиразин-2-карбоксамид) и T-705 (6-фтор-3-гидроксипиразин-2-карбоксамид, известен под торговым наименованием “Фавипиравир”) являются неактивными пролекарствами, которые подвергается метаболическому превращению in vivo в активную форму при помощи фермента гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT). Эффективность этого процесса в клетках человека крайне низка, что делает актуальной задачу получения фосфорибозилированных производных данных пролекарств in vitro. Создан высокоэффективный биокатализатор для получения фосфорибозидов-производных веществ T-705 и T-1105. В результате рационального дизайна активного центра HGPRT из Thermus thermophilus был получен мутант D106G/Y155W с 325-кратным увеличением скорости синтеза фосфорибозида T-705 и 125-кратным – фосфорибозида T-1105. Полученные результаты могут послужить основой для создания новых ферментативных технологий получения противовирусных соединений.

Лаборатория биосинтеза низкомолекулярных физиологически активных соединений (Константинова И.Д.)

Синтез замещенных нуклеозидов 1,2,4-триазол-3-тиона с использованием пуриннуклеозид фосфорилазы E. coli

Сотрудники отделов биотехнологии и структурной биологии (ИБХ РАН) совместно с коллегами из Института химии растительных веществ (Узбекистан) и Института вирусологии им. Д. И. Ивановского синтезировали серию аналогов нуклеозидов на основе 1,2,4-триазола-3-тиона и исследовали их противовирусную активность в отношении вируса простого герпеса.

Производные 1,2,4-триазола обладают широким спектром биологической активности и поиск новых нуклеозидов на их основе является актуальной задачей. Из серии синтезированнных моно- и дизамещённых производных 1,2,4-триазол-3-тиона три соединения оказались субстратами для пуриннуклеозид фосфорилазы E. coli. Для рибозидов и дезоксирибозидов, полученных ферментативным синтезом, было показано, что присоединение углевода у моно- и дизамещённых 1,2,4-триазол-3-тионов происходит по разным атомам азота. Все синтезированные нуклеозиды и гетероциклические основания проверялись на цитотоксичность и активность в отношении вируса простого герпеса первого типа. Индекс селективности двух нуклеозидов (8 и 13) оказался значительно выше, чем у противовирусного препарата рибавирина. Также было обнаружено, что с увеличением липофильности исследуемых соединений увеличивается как их активность, так и токсичность.

Лаборатория инструментов для диагностики и терапии инфекционных заболеваний (Чернов А.С.)

Новые подходы в разработке и применении противомикробных препаратов

Разработан лабораторный прототип препарата на основе бактериофагов, активных против клинических штаммов Klebsiella pneumoniae К14. Выделенные бактериофаги продемонстрировали быструю адсорбцию и лизис клинических изолятов с капсульным типом К14 in vitro. Исследован механизм взаимодействия фага с бактериальным рецептором, включая разрушение капсульного полисахарида. Определены условия хранения препарата: стабильность в суспензии при +4 °C, а также сохранение жизнеспособности после заморозки при -80 °C и лиофилизации.

С помощью репортерной конструкции показано, что 5'-нетранслируемая область гена PRPF19 мРНК содержит расположенную выше открытую рамку считывания (ORF), которая транслируется в клетки человека in vitro и снижает жизнеспособность клеток человека. Регуляторный роль вышестоящей ORF в гене PRPF19 мРНК также может быть важна для жизнеспособности клеток.

Группа химии пептидов (Азев В.Н.)

, 

Лаборатория биологических испытаний (Дьяченко И.А.)

Первые данные о влиянии строения линкерной последовательности и природы С-концевой формы в синтетических конструкциях на основе амилоидогенного и интернализирующих пептидов на их антимикробную активность

С целью поиска новых соединений обладающих антибактериальными свойствами осуществлен дизайн и химический синтез неприродных пептидных конструкций, представляющих собой конъюгаты интернализирующих (Tat, Antp), амилоидогенного пептида, являющегося фрагментом рибосомального белка S1 и линкерной последовательности, содержащие как канонические так и некодируемые аминокислоты. Изучена биологическая активность ряда контструкций в отношении различных штаммов патогенных микроогранизмов. Продемонстрирована значительная противомикробная активность по отношению к микроорганизмам P. aeruginosa, S. aureus (MRSA), E. coli, B. cereus. Пептиды представляющие собой С-концевые амидные формы и содержащие остаток аминокисилоты саркозина в линкерной последовательности имеют более выраженный антимикробный эффект.

Группа молекулярной биотехнологии (Микулинская Г.В.)

Транскрипция и трансляция оперона литических генов бактериофага Т5

При анализе транскрипционной активности идентифицирован сильный конститутивный промотор оперона литических генов hol/endo бактериофага Т5, узнаваемый РНК-полимеразой E. coli, и установлена точка инициации транскрипции. Показано, что единственным стартовым кодоном трансляции токсичного первого продукта, мембранноактивного холина, является неканонический TTG. Анализ областей инициации трансляции (TIR) обоих генов с помощью химерных конструкций, в которых отдельные участки исследуемых регуляторных областей слиты с геном белка-маркера ЕGFP, показал, что TIR холина в 20 раз менее эффективен, чем TIR эндолизина. На общий уровень транскрипции и трансляции влияли также длина конструкта и стартовый кодон холина. Вероятно, сочетание трансляционной супрессии накопления холина и посттрансляционной активации эндолизина кальцием - главные факторы, регулирующие тайминг лизиса клетки-хозяина бактериофагом Т5. Предложенный подход, основанный на применении химерных генетических конструкций, может быть рекомендован для исследования вклада отдельных участков ДНК в транскрипцию, трансляцию и их сопряжение при продукции рекомбинантных белка(ов) природными или искусственными оперонами любой сложности. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 23-24-00210.

Отдел биологических испытаний

Отдел биологических испытаний (Мурашев А.Н.)

Филиал ГНЦ ИБХ РАН получил международный GLP-статус от TURKISH ACCREDITATION AGENCY

Испытательный центр ГНЦ ИБХ РАН «Центр биологических испытаний» получил международный GLP-статус от TURKISH ACCREDITATION AGENCY, подтвердил национальный GLP-статус в Росаккредитации

Отдел биологических испытаний (Мурашев А.Н.)

Испытательный центр ГНЦ ИБХ РАН «Центр биологических испытаний» выполнил доклинические исследования генотерапевтического препарата Тянасен (ASO-GNAO1)

Испытательный центр ГНЦ ИБХ РАН «Центр биологических испытаний» выполнил доклинические исследования генотерапевтического препарата Тянасен (ASO-GNAO1). Тянасен – антисмысловой олигонуклеотид (С172H241N51O94P14S14) для лечения энцефалопатии, вызванной мутацией в гене GNAO1. Разработчик: ООО «Тянасен» (Россия). Производитель: WuXi AppTec (Tianjin) Co., Ltd (Китай). Получено разрешение на проведение клинических исследований.

НПП «Питомник лабораторных животных» (Телегин Г.Б.)

, 

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

, 

Лаборатория инструментов для диагностики и терапии инфекционных заболеваний (Чернов А.С.)

, 

Лаборатория биологических испытаний (Дьяченко И.А.)

Новые подходы для оценки и терапии воспалительных патологических состояний, обусловленных развитием цитокинового шторма

Показано, что оценка уровня фракционной анизотропии спинного мозга у крыс в острый период после модельной криотравмы может служить наиболее эффективным инструментом ранней диагностики для мониторинга и прогнозирования развития последствий ТСМ.

На модели ДАП/ОРДС легкого у мышей было показано, что синтетический амфипатический спиральный пептид L-37pA (ингибитор SR-B рецепторов) блокирует развитие цитокинового шторма, ингибирует острое и хроническое легочное воспаление, предотвращает развитие фиброза и улучшает физиологическую дыхательную функцию легких.

27 декабря

Прикрепленные файлы:

2024_Достижения ИБХ РАН.pdf
pdf, 13.2 Мб