Получение моторных нейронов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациентов с боковым амиотрофическим склерозом — важный шаг к созданию платформы для тестирования подходов к лечению этого нейродегенеративного заболевания. Японские ученые разработали новый протокол, в ходе которого ИПСК человека дифференцируются в моторные нейроны спинного мозга с 80%-ной эффективностью за две недели.
Изображение:
Зрелые моторные нейроны, полученные из ИПСК, обладают электрической активностью.
Credit:
Satoru Morimoto | Пресс-релиз
Боковой амиотрофический склероз (БАС) — нейродегенеративное заболевание, при котором погибают двигательные (моторные) нейроны, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости, дыхательной недостаточности и в итоге к летальному исходу.
В декабре вышло сразу несколько статей, посвященных этому заболеванию. Исследователи из Бельгии, Нидерландов и Великобритании описали дисфункцию ресничек в моторных нейронах при БАС из-за мутации в C21ORF2(подробнее на PCR.news). А в журнале Stem Cell Reports появилась статья японских ученых, которые разработали оптимизированный протокол получения двигательных нейронов из индуцированных стволовых клеток (ИПСК) человека за две недели.
Моторные нейроны из ИПСК пациентов необходимы как для исследования молекулярных механизмов БАС, так и для для тестирования лекарственных препаратов и других терапевтических подходов к лечению этого заболевания. При этом существующие методы достаточно трудоемки, занимают много времени или имеют невысокую эффективность и чистоту получения моторных нейронов.
Авторы исследования использовали как малые молекулы, так и транскрипционные факторы для получения спинномозговых двигательных нейронов человека. Сначала ИПСК обрабатывали двумя различными ингибиторами сигнального пути TGFβ — ингибитором GSK-3β (киназы гликогенсинтазы 3β) и ингибитором BMP дорсоморфином. Затем клетки трансдуцировали вирусами Сендай, несущими гены мышиных транскрипционных факторов Lhx3, Ngn2 и Isl1, которые играют ключевую роль в развитии моторных нейронов.
На седьмые сутки эффективность получения двигательных нейронов оценивали по экспрессии маркеров HB9 и ISLET1: около 71% клеток были положительными по HB9 и около 82% — по ISLET1. Эффективность созревания моторных нейронов, достигающую 80%, подтвердили с помощью проточной цитометрии. РНК-секвенирование показало, что полученные клетки имеют характерный для моторных нейронов транскрипционный профиль. В них экспрессировалась холинацетилтрансфераза (ChAT), необходимая моторным нейронам для продукции и секреции нейромедиатора ацетилхолина. Эти черты сохранялись к 45-му дню дифференцировки, однако по сравнению с 14-м днем наблюдалось снижение количества ISLET1-положительных клеток и присутствие клеток, несущих маркер микроглии AIF1.
Авторам удалось добиться аналогичной эффективности получения моторных нейронов (около 80%) при замене мышиных транскрипционных факторов Lhx3, Ngn2 и Isl1 на человеческие, однако все дальнейшие этапы исследования проводили с использованием мышиных факторов, поскольку их применение лучше охарактеризовано в литературе.
Экспрессия генов HOX определяет принадлежность моторных нейронов к тому или иному отделу спинного мозга. Основываясь на данных об экспрессии HOX в полученных двигательных нейронах, авторы установили, что среди них присутствуют нейроны всех отделов: от шейного и грудного до поясничного и крестцового.
Функциональные эксперименты подтвердили, что получаемые моторные нейроны способны образовать длинные аксоны и обладают устойчивой электрической активностью.
В заключение ученые исследовали четыре линии ИПСК, полученных от пациентов с БАС и несущих различные характерные для этого заболевания мутации. Моторные нейроны, дифференцированные из таких клеток, имели свойственные пациентам патологические характеристики, связанные с конкретными мутациями, такие как накопление и агрегация белков TDP-43 или FUS, сниженная способность к росту и жизнеспособность, а также меньшая длина нейритов (отростков).
Быстрый и эффективный протокол дифференцировки моторных нейронов из ИПСК человека в сочетании с основанной на машинном обучении оценкой их морфологии и жизнеспособности может стать ценным инструментом для исследований БАС и поиска терапии, подчеркивают авторы.
Источник
Setsu et al. Swift induction of human spinal lower motor neurons and robust ALS cell screening via single cell imaging // Stem Cell Reports (2024). DOI: 10.1016/j.stemcr.2024.11.007