Синтетические промоторы — ценный инструмент для биотехнологии, однако для эукариотических клеток их бывает тяжело получать. Ученые из Японии предложили три основных принципа, по которым можно создать индуцибельный промотор, обеспечивающий высокий уровень транскрипции нужного гена и почти лишенный нецелевой активности. Они продемонстрировали, что их подход позволяет нарабатывать в дрожжах различные белки и обеспечивает высокую концентрацию целевого продукта.
Credit:
Kobe University | пресс-релиз
Индуцибельные промоторы необходимы для точного контроля экспрессии целевых генов в синтетических биологических системах. Однако эукариотические промоторы устроены сложнее, чем прокариотические, поэтому их тяжелее конструировать. Японские ученые описали простой и надежный подход к конструированию синтетических дрожжевых промоторов, позволяющих эффективно управлять экспрессией генов.
Синтетические индуцибельные промоторы (iSynP) состоят из двух основных элементов — TATA-бокса и расположенных перед ним бактериальных операторов (специальных репрессорных последовательностей ДНК, контролирующих работу оперона бактерий). Для запуска экспрессии целевого белка им необходимо связаться с синтетическими активаторами транскрипции. Чтобы усилить активацию таких промоторов и предотвратить их «ложное срабатывание», исследователи предложили несколько дополнений в конструкцию. По их задумке, перед бактериальными операторами нужно внести длинную изоляционную последовательность, которая предотвратит ненужную активацию промотора удаленными регуляторными элементами. TATA-бокс следует разместить вплотную к операторам, чтобы усилить активацию промотора, а в самих операторах увеличить число повторов, чтобы предотвратить неявные взаимодействия с присутствующими в клетке другими активаторами транскрипции.
Схема синтетического индуцибельного промотора и влияние трех ключевых параметров — длины изолирующей вставки, расстояния между TATA-боксом и бактериальными операторами, и количеством повторов в этих операторах — на его активацию.
Credit:
Nature Communications (2024). DOI: 10.1038/s41467-024-54865-z | CC BY
Авторы работали с метилотрофными дрожжами Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris). За основу сильного дрожжевого iSynP они взяли промотор, индуцируемый 2,4-диацетилфлороглюцином (DAPG). Дрожжевой промотор альдегидоксидазы KpAOX1 слили с операторной последовательностью phlO. В качестве синтетического активатора транскрипции использовали созданный ранее транскрипционный регулятор rPhlTA — он связывал операторную последовательность и запускал транскрипцию только в присутствии DAPG. Сам rPhlTA экспрессировался отдельно. Под контролем полученного промотора авторы экспрессировали в дрожжах зеленый флуоресцентный белок (EGFP). Добавление DAPG увеличивало уровень EGFP в восемь раз, однако и в отсутствие индуктора дрожжи синтезировали этот белок.
Чтобы найти причину такой неспецифической активации, авторы внесли случайную мутацию в последовательность TATA-бокса — эта мутация снизила как индуцированную, так и спонтанную транскрипцию. По-видимому, на «утечку» промотора влияли удаленные регуляторные последовательности. Чтобы это компенсировать, авторы внесли изолирующую последовательность с 5`-стороны от iSynP. Это резко снизило нецелевую активацию — в 376 раз — и очень слабо затронуло экспрессию при индукции (она уменьшилась приблизительно в 1,5 раза).
Затем авторы изучили, как расстояние между элементами синтетического промотора влияет на его работу. Они обнаружили, что индуцированная экспрессия увеличивалась при сокращении расстояния между phlO и TATA-боксом до 40 нуклеотидов или менее. А вот уменьшение расстояния между ТАТА-боксом и стартовым кодоном оказывало очень мало влияния.
По аналогии с полученным DAPG-зависимым промотором ученые сконструировали еще два — индуцируемые доксициклином и N-(кетокапроил)-D,L-гомосерин-лактоном (HSL). Они добились повышения уровня экспрессии репортерного гена более чем в 1000 раз.
Для демонстрации практического применения исследователи наработали в дрожжах несколько фармацевтических белковых препаратов, в частности, нанотела гонтивимаб (его используют для лечения респираторно-синцитиального вируса) и каплацизумаб (им лечат приобретенную тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру).
Кроме того, авторы показали, что можно использовать обратную схему, в которой экспрессия целевого гена блокируется индуктором — эти варианты практичны, если речь идет о крупномасштабном производстве белка.
Разработанная платформа для экспрессии позволяла также получать трудноэкспрессируемые белки, например, вирусные антигены — это ученые продемонстрировали, наработав белок SARS-CoV-2 для иммунизации цыплят.
Предложенные три принципа конструирования синтетических индуцибельных промоторов послужат руководством для создания гибких и контролируемых систем экспрессии, которые можно применять в микробиологическом производстве.
Источник
Tominaga, M., et al. Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. // Nat Commun 15, 10653 (2024). DOI: 10.1038/s41467-024-54865-z