Авторы статьи в Science Advances обнаружили, что белок PDAP1 играет решающую роль в репликации вируса гепатита A (HAV). Этот небольшой фосфопротеин взаимодействует с эукариотическим белком eIF4E, который необходим для трансляции РНК HAV. В то же время PDAP1 по-видимому, способствует адаптации клеток к стрессу эндоплазматического ретикулума (ЭПР), как при вирусной инфекции, так и при других состояниях.
Изображение:
Вирус гепатита А
Credit:
NIH | flickr.com | CC BY 2.0
Ученые из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл обнаружили, что белок PDAP1 необходим для репликации вируса гепатита А (HAV). HAV – это высококонтагиозный пикорнавирус, вызывающий инфекционный гепатит (болезнь Боткина). В отличие от вирусов гепатитов B и C, HAV не приводит к хроническим заболеваниям печени, но может сопровождаться тяжелыми симптомами, иногда протекает с острой печеночной недостаточностью и может закончиться летальным исходом. Эффективные вакцины против гепатита А существуют с 1990-х годов, но прививки против этого заболевания обычно не входят в нацкалендари, а делаются по эпидпоказаниям, перед поступлением в детские учреждения или в группах риска. Открытие нового белка, ответственного за репликацию вируса, может способствовать разработке новых противовирусных препаратов.
Вирус гепатита А существенно отличается от других пикорнавирусов и все еще недостаточно изучен, несмотря на его широкое распространение. В частности, его трансляция требует участия эукариотического кэп-связывающего белка eIF4E, хотя его геном кэпа не имеет; трансляция других пикорнавирусов от этого белка не зависит.
Геномные CRISPR-скрининги выявили и другие белки человека, необходимые для репликации HAV. Авторы нового исследования в одной из своих предыдущих работ провели CRISPR скрининг более 19000 генов и установили, что белок PDAP1, ранее неизвестный в контексте репликации вируса, критически важен для жизненного цикла HAV. Другая исследовательская группа показала, что PDAP1 имеет решающее значение для защиты В-клеток от гибели, индуцированной стрессом. Можно было предположить, что экспрессия этого белка в клетках печени растет на фоне стресса, вызванного инфекцией, и это облегчает вирусу его использование.
Чтобы изучить роль PDAP1 в репликации вируса гепатита А, исследователи создали с помощью CRISPR-Cas9 линию клеток гепатомы человека с дефицитом экспрессии PDAP1. При инфекции HAV в этих клетках уровень вирусной РНК был в 50–75 раз ниже, чем в нормальных. В PDAP1-дефицитных клетках также была подавлена репликация вируса, экспрессирующего нанолюциферазу (NLuc), при этом восстановление экспрессии PDAP1 с помощью лентивирусной трансдукции восстанавливало репликацию вируса.
Для исследования роли PDAP1 в репликации HAV in vivo исследователи получили мышей с нокаутом гена Pdap1 в гепатоцитах. Такие мыши демонстрировали полную устойчивость к инфекции HAV. Вирусная РНК отсутствовала их в фекалиях, а уровень маркера повреждения печени — аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке оставался в норме.
Затем ученые провели ряд экспериментов, чтобы выяснить, как именно PDAP1 способствует репликации HAV. С помощью иммунопреципитации и масс-спектрометрии они обнаружили, что PDAP1 взаимодействует с eIF4E, который участвует в инициации трансляции. Это взаимодействие необходимо для трансляции РНК HAV, которая, в свою очередь, необходима для репликации вируса. Мутации в PDAP1, нарушающие связывание с eIF4E, ингибировали трансляцию и репликацию вирусного генома.
Кроме того, ученые обнаружили, что PDAP1 взаимодействует с eIF1AX, еще одним фактором инициации трансляции, и что это взаимодействие тоже важно для трансляции вирусной РНК HAV. Эти результаты подтверждаются экспериментами с нокаутом eIF1AX, которые показали, что этот фактор необходим как для трансляции, так и для репликации HAV.
Ученые также исследовали роль PDAP1 в ответе клеток на стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР). При заражении клетки вирусом в ЭПР накапливаются вирусные или неправильно свернутые белки. Оказалось, что PDAP1 необходим для базальной экспрессии белка XIAP (ингибитор апоптоза), а также для повышенной экспрессии белков BiP (шаперон ЭПР), ATF4 (фактор транскрипции) и CHOP (проапоптотический белок) в условиях стресса ЭПР. Эти белки способствуют выживанию клеток в условиях стресса. Отсутствие этих белков в печени мышей с нокаутом Pdap1, вероятно, связано с нарушением трансляции, учитывая неконтролируемое увеличение экспрессии их мРНК при стрессе.
Таким образом, PDAP1 — многофункциональный белок, который играет важную роль как в репликации вируса гепатита А, так и в поддержании жизнеспособности клеток печени; он обеспечивает трансляцию белков, необходимых для адаптации к различным видам стресса. Авторы исследования считают, что PDAP1 может быть перспективной мишенью для разработки новых противовирусных препаратов. Более того, экспрессия PDAP1 повышается и в опухолевых клетках; понимание его роли в реакции на стресс может быть важным и для молекулярной онкологии.
«Теперь мы знаем, что этот белок является частью специальной программы, которую клетки используют для экспрессии определенного подмножества белков в условиях стресса, — говорит руководитель исследования Стэнли Лемон. — Гепатит А может узурпировать эту программу — этот белок — для создания собственных белков, чтобы реплицироваться и успешно инфицировать клетки печени. Мы обнаружили, что когда мы выключаем PDAP1, вирус больше не может воспользоваться этой специальной программой, не может реплицироваться или вызывать воспаление в печени».
Источники
Takayoshi Shirasaki, et al. Hepatovirus translation requires PDGFA-associated protein 1, an eIF4E-binding protein regulating endoplasmic reticulum stress responses // Science Advances. 10, eadq6342 (2024). DOI: 10.1126/sciadv.adq6342
Цитата по пресс-релизу