Во Флориде обитает 54 вида инвазивных рептилий, в том числе змей. Их тяжело обнаруживать, потому что они малоактивны и обитают на сложном ландшафте. Ученые из Флоридского университета разработали мультиплексную панель, позволяющую выявлять экологическую ДНК четырех крупных инвазивных змей при помощи цифровой ПЦР. В лабораторных опытах панель детектировала ДНК в образцах почвы из вольера, в котором содержалась змея, даже спустя две недели. Авторы планируют дальнейшее тестирование метода в полевых условиях.
Изображение:
Темный тигровый питон.
Credit:
123rf.com
Инвазивные виды представляют собой острую проблему по всему миру. Одной из наиболее «горячих» точек инвазии является Флорида, где обитает 54 инвазивных вида рептилий — от общего их числа это составляет 27%. Экологические службы привлекают большие объемы ресурсов для борьбы с инвазиями, однако процесс поиска «неродных» видов затрудняется низкой активностью змей и сложным ландшафтом, особенно в национальном парке Эверглейдс — тропическом болотистом заповеднике на юге полуострова. Ученые из Флоридского университета разработали новую панель для обнаружения экологической ДНК при помощи цифровой ПЦР, которая может помочь в обнаружении инвазивных видов питонов.
Экологическая ДНК (она же свободная ДНК и ДНК окружающей среды, эДНК) представляет собой свободные молекулы ДНК в окружающей среде. С их помощью можно обнаружить присутствие животного путем анализа проб почв и воды. Экологическая ДНК уже успешно применялась для выявления инвазивных видов, однако точности классических методов недостаточно для того, чтобы принимать административные решения. На смену им авторы статьи предложили применять цифровую ПЦР. Метод основан на разбиении реакции на множество отдельных — они проходят в микрокаплях или лунках, куда попадают крайне малые количества целевой ДНК. Это позволяет снизить влияние ингибиторов реакции и повысить предел обнаружения. Финальный результат реакции считывается как процент лунок с активировавшейся в процессе ПЦР флуоресцентной пробой TaqMan, на основе чего рассчитывается концентрация ДНК в исходном образце.
Исследователи разработали мультиплексную панель, направленную на выявление четырех инвазивных видов крупных змей — темного тигрового питона (Python bivittatus), обыкновенного удава (Boa constrictor), иероглифового питона (Python sebae) и радужного удава (Epicrates cenchria). Панель содержит универсальный праймер, амплифицирующий фрагмент гена субъединицы I митохондриальной цитохром с-оксидазы длиной 621 нуклеотид, и видоспецифичные пробы, несущие различные флуоресцентные метки.
В тестах с ДНК, полученной из мышечной ткани и разведенной до известных концентраций, положительные результаты были получены для концентраций от 50 нг/л.
Для тестирования панели на контролируемых образцах экологической ДНК авторы отбирали пробы из контейнера с водой, в котором находился темный тигровый питон, а также образцы почвы из вольера с той же змеей. Отбор проб воды проводился через 5 мин, 30 мин, 1, 2 и 3 часа после помещения змеи в контейнер. Отборы проб почвы проводили через 24 часа, 1 и 2 недели после удаления питона из вольера, в котором он содержался 8 дней.
ДНК в пробах воды обнаруживалась уже на пятой минуте нахождения змеи в контейнере с максимальной концентрацией на отметках 5 и 30 минут в разных повторностях эксперимента. ДНК в образцах почвы обнаруживалась вплоть до двух недель после удаления змеи из вольера.
Авторы считают, что лабораторные опыты показали высокую эффективность разработанной панели. Они планируют дальнейшее тестирование метода в полевых условиях в сотрудничестве с экологическими службами — оно будет заключаться в анализе образцов из мест с подтвержденным присутствием целевых видов.
Источник
Miller, M.A., et al, Development of a Tetraplex Digital PCR Assay for the Detection of Invasive Snake Species in Florida, USA // Ecol Evol, 14: e70598, published November 20, 2024, DOI: 10.1002/ece3.70598