Ученые из Рочестерского университета совместили опто- и хемогенетику, чтобы объединить преимущества этих двух подходов к нейромодуляции (точность, скорость и неинвазивность). Они провели опыты на мышах, в мозге которых экспрессировался люминопсин — этот химерный белок состоит из опсина и люциферазы. Люцифераза взаимодействует с вводимым в организм люциферином, а на его люминесценцию реагирует светочувствительный рецептор опсин. Авторы подробно проанализировали разные условия введения субстрата — эти данные они планируют использовать для более тонкого контроля активности нейронов, экспрессирующих люминопсин.
Credit:
Павел Русанов
Нейромодуляция — контроль активности нервных клеток — может основываться на опто- или хемогенетике. Оптогенетические методы обладают высокой точностью, но требуют инвазивных процедур, например, операции на черепе для установки импланта, поддерживающего источник света. Хемогенетические методы хотя и менее инвазивны, но и обладают меньшей временной точностью. Чтобы компенсировать недостатки того или иного подхода, команда ученых из Рочестерского университета исследованиях разработала гибридный метод, — в своих предыдущих исследованиях исследователи соединили опто- и хемогенетику. Так называемая биолюминесцентная оптогенетика (BL-OG) позволяет производить оптогенетическую модуляцию с использованием внутренней биолюминесценции. Теперь этот же коллектив проанализировал, как условия введения субстрата влияют на биолюминесцентную активность в мозге мыши.
В качестве животной модели использовали линию мышей C57/BL6. Доставка генетической конструкции в мозг осуществлялась с помощью аденоассоциированного вируса, кодирующего люминопсин — люциферазу, слитую с опсином. В качестве субстрата использовали люциферин, который вводили внутривенно.
Съемку проводили через предварительно истонченный череп мыши, которая бегала в колесе в светонепроницаемой камере. Перед экспериментами с биолюминесценцией мышам вводили в хвостовую вену флуоресцентный краситель, чтобы оценить, как быстро вещество достигнет мозга при такой инъекции. Базовый уровень флуоресценции измеряли в течение 10 минут (1 кадр в минуту), а на одиннадцатом кадре вводили люциферин. Затем визуализация продолжалась еще 50 минут (50 кадров), после чего по полученным данным строили кривую интенсивности биолюминесценции для каждого животного.
Чтобы определить влияние дозировки на биолюминесценцию, мышам внутривенно со скоростью 1 мл/мин вводили 250 мкл люциферина в шести различных концентрациях: 0,74; 0,98; 1,72; 2,46; 3,19 и 3,93 ммоль/л.
Системное введение люциферина вызывало биолюминесцентную активность уже в течение первых 60 секунд при любой концентрации. При этом концентрация не влияла ни на время начала биолюминесценции, ни на время до пиковой активности. Эксперименты на дозозависимость показали, что активность биолюминесценции систематически возрастает при увеличении концентрации люциферина. Также она влияла на среднее время биолюминесценции — время затухания увеличивалось при повышении концентрации субстрата. Дополнительная съемка с большей частотой кадров (каждые шесть секунд) подтвердила, что биолюминесцентная активность коррелирует с дозой субстрата.
Влияние скорости введения на эффект проверяли, вводя мышам 250 мкл этого субстрата в концентрации 3,93 ммоль/л. При этом использовали скорости 0,1; 0,2; 0,3 и 1 мл/мин. Активность биолюминесценции в этих экспериментах не определялась скоростью введения, однако время начала уменьшалось в зависимости от скорости экспоненциально, а время до пика — линейно.
Контрольные эксперименты на мышах дикого типа, которым вводили люциферин, показали наличие «фотонного шума», обусловленного техническими особенностями камеры. У мышей, экспрессирующих люминопсин, биолюминесценция была в 15 раз выше, чем в контроле — это подтверждает отсутствие автобиолюминесценции люциферина.
Таким образом, хотя начало биолюминесценции и пик активности не зависят от дозы люциферина, продолжительность растет линейно при увеличении его концентрации. В целом, системные инъекции люциферина вызывают быструю биолюминесцентную реакцию в головном мозге.
Главный исследователь лаборатории тактильных ощущений Рочестерского университета профессор Мануэль Гомес-Рамирес оценивает перспективы биолюминесцентной оптогенетики: «Преимущество такой технологии состоит в том, что мы можем провоцировать активность в мозге без каких-либо проводов. С использованием такого неинвазивного метода создается меньше рисков, что инъекция или что-нибудь еще пойдет не так. Если мы хотим сделать нашу методику стандартной для использования в лаборатории, а в будущем и в клинике, важно установить все параметры для ее использования. Наши результаты позволяют нам работать над точной регулировкой желаемых эффектов биолюминесцентной оптогенетики в зависимости от потребностей».
Источник
Murphy E.F. et al. Strength of Activation and Temporal Dynamics of BioLuminescent-Optogenetics in Response to Systemic Injections of the Luciferin. // NeuroImage, published online 2 October 2024. DOI: 10.1016/j.neuroimage.2024.120882
Цитата по пресс-релизу