Чешские и немецкие ученые определили механизм взаимодействия между микротрубочками и актиновым цитоскелетом в ходе митоза. Они показали, что белок FAM110A, локализованный на полюсах клетки, обеспечивает взаимодействие между актином и кинетохорными микротрубочками, тем самым способствуя формированию веретена деления. Дефицит этого белка нарушал сборку веретена и вызывал задержки митоза.
Изображение:
Колокализация актина и тубулина в клетке, требующая участия FAM110A.
Credit:
Robert Grosse / Universität Freiburg | пресс-релиз
Митоз и цитокинез — сложные процессы, требующие точной регуляции и координации различных элементов цитоскелета. Симметричное распределение генетической информации во время деления клетки зависит от формирования биполярного митотического веретена, которое организует сегрегацию хромосом в дочерние клетки. Митотические веретена состоят из кинетохорных, полярных и астральных микротрубочек, которые прикрепляются к сестринским хроматидам и распределяют их к противоположным полюсам клетки. Эти события управляются контрольной точкой сборки веретена деления (SAC), которая отслеживает правильное прикрепление всех кинетохор к микротрубочкам веретена.
Кортикальные актиновые микрофиламенты важны для правильного позиционирования митотических веретен и также для формирования сократительного актомиозинового кольца во время цитокинеза. В то время как основная функция микротрубочек в формировании митотических веретен хорошо установлена, функция актиновых микрофиламентов в этом процессе долгое время оставалась спорной. Недавние исследования показали, что центросомы не только играют роль центров организации микротрубочек, но и способствуют сборке актиновых филаментов. Полимеризация актина из центросом в раннем митозе предшествует формированию кинетохорных микротрубочек и направляет этот процесс, а перинуклеарный актин ограничивает разделение центросом в профазных клетках и ограничивает рассеивание хромосом после разрушения ядерной оболочки.
Ученые из Чехии вместе с коллабораторами из Германии обнаружили белок FAM110A, который локализуется на полюсах веретена и способствует формированию митотического веретена, обеспечивая взаимодействие между актином и кинетохорными микротрубочками. Кроме того, дефицит FAM110A ухудшал сборку веретена и задерживал переход к анафазе.
Ученые стремились определить и функционально охарактеризовать взаимодействие FAM110A с обеими системами цитоскелета. Сначала исследователи провели выравнивание последовательностей, которое выявило значительный уровень консервативности среди ортологов FAM110A у позвоночных, показывая наибольшее сходство в N- и C-концевых областях, разделенных более вариабельной центральной областью. Анализ с помощью AlphaFold2 предсказал возможное взаимодействие FAM110A с тубулином через альфа-спирали в его структуре.
Основываясь на этих предсказаниях, ученые создали панель делеционных мутантов FAM110A, меченного EGFP, и при помощи иммунопреципитации проверили их взаимодействия в митотических клетках и подтвердили, что актин и тубулин связываются с N- и C-концевыми доменами FAM110A, соответственно. Более того, FAM110A-Δ188-221 не смог взаимодействовать с тубулином, в то время как все еще связывался с актином. Анализ серии укороченных версий N-концевого домена FAM110A выявил, что остатки 40–61 необходимы для связывания с актином, причем домен связывания с актином консервативен в этом белке.
Чтобы определить, участвует ли домен связывания с актином в митотической функции FAM110A, команда создала клетки RPE, стабильно экспрессирующие дикий тип EGFP-FAM110A, мутант, не связывающийся с актином (EGFP-FAM110A-Δ40-61), и мутант, не связывающийся с тубулином (EGFP-FAM110A-Δ188-221). Было обнаружено, что удаление домена связывания с актином уменьшило локализацию EGFP-FAM110-Δ40-61 в кортикальном слое клетки, но его локализация на полюсах веретена во время митоза сохранилась. Однако удаление домена связывания с тубулином значительно уменьшило уровень мутанта EGFP-FAM110A-Δ188-221 на полюсах веретена, но не повлияло на его локализацию в кортикальном слое. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что локализация FAM110A на полюсах веретена осуществляется через его C-концевой домен.
Используя проточную цитометрию и измеряя долю клеток, содержащих фосфорилированный митотический маркер MPM2, ученые выяснили, что мутанты EGFP-FAM110A-Δ40-61 и EGFP-FAM110A-Δ188-221 не смогли устранить задержку митоза, вызванную дефицитом эндогенного FAM110A. У мутантов также наблюдалось уменьшение плотности микротрубочек митотического веретена. Более того, приблизительно в 60% клеток с дефицитом FAM110A нарушалось выравнивание хромосом в метафазе.Важно отметить, что эктопический FAM110A дикого типа полностью устранял такое нарушение.
Ученые выдвинули гипотезу, что FAM110A может участвовать в формировании актиновых структур веретена и их взаимодействии с микротрубочками веретена. Используя конфокальную микроскопию, команда исследователей обнаружила, что EGFP-FAM110A колокализуется с F-актином, а также с микротрубочками веретена в профазных клетках. In vitro анализ связывания показал, что дикий тип EGFP-FAM110A и мутант EGFP-FAM110A-Δ40-61 смогли связываться с микротрубочками, тогда как взаимодействие полностью отсутствовало у мутанта EGFP-FAM110A-Δ188-221.
Митотическая функция FAM110A регулируется фосфорилированием его C-концевой области казеинкиназой 1 (CK1). Ученые обнаружили, что ингибирование CK1 нарушает организацию веретенообразного актина в профазных клетках — площадь F-актина вокруг полюсов веретена, длина филаментов и количество направляющих событий уменьшались при ингибировании этой киназы. Аналогично, ингибирование CK1 или истощение изоформы этой киназы CSNK1D при помощи малой интерферирующей РНК затрудняло сборку F-актина во время выхода из митоза, вызванного ингибированием CDK1. FAM110A, фосфорилированный CK1, опосредует взаимодействие между актином веретена и собственно митотическим веретеном, таким образом способствуя своевременному прохождению митоза.
Данное исследование показало, что FAM110A взаимодействует с F-актином и тубулином через свои N- и C-концевые домены, соответственно. Авторы работы предполагают, что взаимодействие с актином через N-концевой домен FAM110A необходимо для его митотической функции, выравнивания хромосом и обеспечения целостности веретена. Нарушение взаимодействий FAM110A может быть причиной хромосомной нестабильности в раковых клетках и использоваться для диагностики заболевания в будущем.
Источник
Cecilia Aquino-Perez, et al., FAM110A promotes mitotic spindle formation by linking microtubules with actin cytoskeleton // PNAS, July 12, 2024, 121 (29) e2321647121. DOI: 10.1073/pnas.2321647121