Международная исследовательская группа восстановила 3D-структуру хроматина шерстистого мамонта возрастом 52 000 лет, найденного в Якутии. Это впервые было выполнено для образца древней ДНК. Результаты дают представление о том, какие гены были активны в клетках кожи мамонта, а также делают возможной сборку генома на уровне хромосом.
Фото:
Валерий Плотников и Дэн Фишер исследуют шкуру мамонта.
Credit:
Love Dalén | Пресс-кит
Авторы статьи, опубликованной в Cell, адаптировали методику, позволяющей определить, как организована геномная ДНК в ядре клетки, для анализа ДНК из кожи мамонта. «Спонтанная замораживание туши мамонта в холодном климате Сибири, возможно, привело к витрификации, что сохранило морфологию образца вплоть до уменьшения масштаба на восемь порядков, от трехметровой туши до 50-нанометровых петель хроматина», — пишут авторы
Успехи исследований древней ДНК (aDNA или аДНК) у всех на слуху. В 2022 году один из основателей палеогеномики Сванте Паабо получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Однако характерная особенность древней ДНК состоит в том, что она разрушается до коротких фрагментов. Из-за этого представляется невозможным реконструировать трехмерную архитектуру генома, между тем пространственная организация играет огромную роль в его функции. (Подробнее об этом можно узнать из доклада Сергея Разина, прочитанного в рамках лектория «Настоящая биология».) Более того, при реконструкции древних геномов прочитанные короткие участки картируются на геномы ближайших живых родственников исследуемого вида, а такой подход не позволяет увидеть хромосомные перестройки — перенос протяженного участка из одной хромосомы в другую или даже появление двух коротких хромосом вместо одной длинной.
Реконструировать структуру хромосом у современных видов помогает метод Hi-C. Метод включает следующие этапы: обработка формальдегидом и ковалентное сшивание участков ДНК, которые находятся рядом друг с другом (это могут быть как соседние участки одной нити ДНК, так и участки разных нитей), лизис клеток, рестрикция ДНК и лигирование концов сшитых «обрезков». Лигированные химерные фрагменты очищают, секвенируют и картируют на геном, а затем строят карту контактов. Чем чаще два участка генома оказываются сшитыми, тем ближе, очевидно, они находились в ядре живой клетки. Результаты Hi-C говорят о том, как организованы в хромосомы участки генома, а также о трехмерной архитектуре — хромосомных территориях, активных и неактивных участках генома и т.д.
Казалось бы, применить этот метод к аДНК невозможно, так как мелкие фрагменты свободно диффундируют. Однако останки мамонтов — особый случай. Если ткань быстро замерзла, причем жидкие компоненты перешли в стеклообразное состояние, и затем подверглась дегидратации при низких температурах, то расположение фрагментов, отражающее 3D-структуру хроматина, могло сохраниться. Авторы назвали такие образцы «хромогласс» — «хромосомное стекло». Они провели ряд экспериментов с современными образцами и доказали, что высушивание стабилизирует 3D-структуру генома.
Десятки образцов тканей мамонтов тестировали на протяжении пяти лет, пока не выбрали самку мамонта возрастом около 52 тысяч лет, найденную в Якутии около поселка Белая Гора. У нее взяли для анализа фрагмент кожи за ухом. Гистологическое исследование подтвердило удовлетворительную сохранность образца. Клеточные ядра окрашивались красителем DAPI и выглядели сморщенными, что говорило о дегидратации.
Взятие образца. Фото: Love Dalén
Волосяной фолликул, дерма и мышцы мамонта. Credit: Elena Kizilova
Данные о контактах хроматина получили с помощью модифицированного протокола Hi-C — PaleoHi-C. Образцы фиксировали на месте с помощью этанола, чтобы остановить активность микроорганизмов, сшитые фрагменты изолировали на бусинах. Проводить рестрикцию ДНК в случае палеообразцов нет необходимости, а для амплификации библиотеки применяется специальный протокол, дружественный к аДНК. Помимо образца из Белой Горы, PaleoHi-C -анализ выполнили для фрагмента хобота знаменитого мамонтенка Юки (возраст около 39 тысяч лет), но данные были получены более скудные.
Для мамонта возрастом 52 тысячи лет получили около 4,4 млрд парных ридов. Как это обычно происходит в случае аДНК, мамонту принадлежали только 2,55% (более 113 млн) ридов. Из них около 4,6 млн могли отражать контакты между дальними участками хроматина.
Авторы выполнили сборку геномов африканского и индийского слонов на уровне хромосом, используя опубликованные и вновь полученные данные Hi-C. Несмотря на меньшее количество данных, ключевые характеристики контактов хроматина у мамонта выглядели так же, как у слонов, например, частота контактов тем меньше, чем дальше друг от друга участки хромосомы.
Чтобы понять, как именно геном мамонта организован в хромосомы, авторы проводили выравнивание данных Hi-C мамонта на референсный геном близкого вида (африканского слона); при этом выявляются изменения, связанные с крупномасштабными перестройками хромосом в ходе эволюции, и это позволяет в итоге получить правильную сборку целевого генома. Эффективность такого подхода авторы проверили на паре «осел-лошадь». Геномные сборки для шерстистого мамонта и обоих видов слонов получились сходными. У мамонта, как и у современных слонов, было 28 хромосом.
Соавтор работы Марианн Дехаск в лаборатории древней ДНК. Credit: Love Dalén
Также авторам удалось охарактеризовать архитектуру хромосомных территорий мамонта и расположение активных и неактивных компартментов — чередование областей с повышенным и пониженным числом контактов. (На карте контактов это выглядит как клетчатый, «пледовый» узор.) Авторы сравнили распределение компартментов в клетках кожи мамонта и в различных тканях азиатского слона. Сходство с кожей слона было максимальным, следовательно, можно предположить, что трехмерная структура генома мамонта сохранила естественный паттерн активности. Более того, в тех участках, где между мамонтом и слоном были отличия, находились такие гены, как Barx2, делеция которого у мышей приводит к короткой шерсти, и Dusp10, регулятор дифференциации бурых адипоцитов.
На следующем уровне детализации авторы обнаружили «отпечатки» петель хроматина в геноме мамонта. Для этого уровня карта контактов, полученная из палеообразца, была слишком разреженной, тем не менее многие петли, аннотированных у слона, присутствовали и у мамонта.
Наконец, поскольку мамонт был самкой, можно было надеяться обнаружить присутствие тельца Барра — инактивированной и плотно упакованной второй Х-хромосомы, то есть уменьшенную частоту контактов между ней и другими хромосомами. Действительно, именно это и наблюдалось. Кроме того, авторы увидели признаки тетрадной структуры инактивированной Х-хромосомы — четыре выраженных супердомена (а не два, как в Х-хромосомах человека или мыши). Та же структура присутствовала у самок слонов, но у самцов ее не было.
Авторыотмечают, чтокритическимфактором, ответственным за сохранение трехмерной структуры генома,можетбытьбыстроевысыханиеобразцапослесмерти. Это могло произойтивестественныхусловияххолодныхисухихзимСеверо-ВосточнойСибири. Возможно, анализ Hi-C даст результаты и для более древних образцов, сохранившихся в вечноймерзлоте. С этой точки зрения стоит рассмотреть и образцы, мумифицированные в жарком климате. Не исключено, что информация о трехмерной структуре генома вымерших видов станет очередным шагом к их «воскрешению».
Гистологические исследования образцов проводили российские ученые, в их числе Елена Кизилова, на тот момент сотрудник Института цитологии и генетики СО РАН. Мы задали ей несколько вопросов по электронной почте о том, что не вошло в статью.
В чем особенности гистологического исследования мамонта?
Если совсем кратко, то в следующем.
1. Ткани из мерзлоты — это всегда трупный материал, причем трупный материал многократно замерзавший и оттаивавший. Мне пришлось серьезно засесть за спецлитературу по судебной гистологии (есть такая научно-практическая дисциплина!) и по патогистологии.
2. Лучше всего сохраняются те «места» мамонта, в которых много соединительной ткани. В этой особенности есть как плюсы, так и минусы. Плюсы — да, может повезти, и попадется и вправду сохранный участок. Минусы — очень трудно обрабатывать (заключать, красить и т.д.)
3. Материал включает в себя целый букет артефактов, связанных с прижизненной и постмортальной контаминацией. По сути, гистологу приходится иметь дело со специфическим «трупным сообществом». Отсюда - отдельная задача вычленить эти контаминанты.
4. К сожалению, пока еще очень мало референтного материала. Гистологический анализ проводился неоднократно. Есть несколько хороших статей, но по-видимому, каждый случай уникален. Что-то повторяется, что-то нет. В нашей работе, например, были какие-то паразиты (или сапрофаги) в эпидермисе, с трактовкой которых пришлось изрядно повозиться.
5. Предикция, на мой взгляд, тоже пока работает слабо. Мы с зарубежными коллегами много и плодотворно спорили об ожидаемом источнике остатков ядер, пока не были получены первые реальные картинки.
По каким признакам можно отличить ткань, подходящую для исследования?
Я ориентировалась на присутствие хроматина в срезах, узнаваемую ядерную организацию и соответствие паттерна окраски при использовании разных хроматинспецифических красителей. Как морфологу, мне было важно именно это.
Вы исследовали только образцы мамонта из Белой Горы или образцы Юки тоже?
Не могу сказать. Мне просто предоставили образцы, я работала с ними «вслепую».
Credit: Love Dalén
Источник
Sandoval-Velasco, M. et al. Three-dimensional genome architecture persists in a 52,000-year-old woolly mammoth skin sample // Cell (2024). DOI: 10.1016/j.cell.2024.06.002