Помимо структурных белков, геном вируса гепатита Е кодирует полипротеин, содержащий в том числе гипервариабельный участок. Немецкие ученые проанализировали перестройки в этом участке в вирусе, который был выделен из сыворотки крови пациента с хронической инфекцией. Оказалось, что вирус гепатита Е способен встраивать в свой гипервариабельный участок фрагменты РНК генов хозяина, тем самым повышая эффективность репликации.
Credit:
123rf.com
Гепатит Е является причиной 20 миллионов инфекций и 70 тысяч летальных случаев ежегодно. Часто инфекция протекает бессимптомно или с умеренной общей симптоматикой, однако в некоторых случаях болезнь может стать хронической. Специфической терапии от гепатита Е не существует; для его лечения применяют рибавирин — противовирусный препарат широкого спектра действия.
Геном вируса гепатита Е представлен одноцепочечной РНК. Помимо структурных белков он кодирует полипротеин, содержащий ряд различных доменов: метилтрансферазный, протеазный и т. д. В этот полипротеин также входит гипервариабельный участок, который, скорее всего, связан с адаптацией к хозяину. Немецкие ученые исследовали вставки и геномные перестройки, которые встречаются в этом участке.
Исследователи получили образцы вируса гепатита Е, выделенного из сыворотки крови реципиента донорского органа. В крови пациента как минимум 426 дней детектировалась РНК вируса гепатита Е, сам он погиб на 653 день после пересадки от хронической инфекции. Его лечили рибавирином в течение примерно 250 дней, что привело к временному снижению титра вируса и повышению уровня гамма-глутамилтрансферазы — фермента печени, однако затем вирусная нагрузка восстановилась. Образцы подвергли клональному анализу, и оказалось, что в большинстве клонов, где детектировался вирус гепатита Е, содержались перестройки или вставки в гипервариабельном участке его генома. Чаще всего встречались дупликации фрагментов РНК этого же участка. Также исследователи обнаружили вставки РНК человеческих генов SERPINA1, TRIM22 и ALB. При этом в фрагментов РНК генов SERPINA1 и TRIM22 содержалось несколько точечных мутаций.
Чтобы оценить влияние таких вставок на эффективность репликации вируса, ученые внесли вставки в репликон и в полный геном вируса штамма Kernow-C1-p6, при этом новые фрагменты заменили вставку RPS17 в гипервариабельном участке оригинального штамма. Оказалось, что все проанализированные вставки увеличивали эффективность репликации вируса и его способность образовывать вирусные частицы, но не влияли на чувствительность к рибавирину. При этом точечные мутации, содержащиеся во вставках, были необходимы для этого эффекта.
Аналогичные результаты ученые получили, внеся в гипервариабельный участок вируса гепатита Е семь других вставок, описанных в литературе. Среди них были вставки РНК генов человека NF787, ITIH2, EEF1A1, GATM и т. д.
Используя биоинформатические инструменты, исследователи проанализировали влияние вставок РНК хозяина на белковую структуру гипервариабельного участка. Оказалось, что при наличии вставок повышалось содержание полярных, в частности, положительно заряженных аминокислот в белке. Так, в три раза чаще встречался лизин, который часто подвергается различным посттрансляционным модификациям. Это согласовалось с предсказанием того, что при наличии вставок повышается частота фосфорилирования, гликозилирования, ацетилирования и убиквитинилирования. Это указывает на то, что «украденные» вирусом фрагменты РНК хозяина могут предоставлять ему эволюционное преимущество в развитии хронической инфекции.
Помимо этого, лизином богаты последовательности сигналов ядерной локализации — фрагментов белковых молекул, которые необходимы для их транслокации в ядро. Действительно, сигнал ядерной локализации содержится даже во вставке RPS17 штамма вируса гепатита Е p6. Чтобы проверить значимость лизиновых и аргининовых остатков в этой последовательности, ученые провели аланиновое сканирование — направленный мутагенез последовательности, при котором исследуемые аминокислотные остатки заменяются на аланин. Замена лизинов и аргининов в сигнале ядерной локализации вставки RPS17 штамма p6 снижала эффективность репликации вируса и его способность к образованию вирусных частиц, хотя не влияла на чувствительность к рибавирину. В частности, если все лизины и аргинины в этой последовательности одновременно заменяли на аланин, то уровень репликации вируса снижался до уровня менее вирулентного штамма p1, и мутантный вирус мог образовывать лишь 5,7% от числа вирусных частиц, которое может образовывать вирус дикого типа. В то же время титр вируса у такого мутантного штамма все равно был в 32 раза выше по сравнению со штаммом p1. Это указывает, что на эффективность репликации вируса влияют и другие факторы.
Исследователи также предсказали последовательности сигналов ядерной локализации в гипервариабельном участке вируса p6, а также во вставках SERPINA1 и TRIM22. Однако транслоцироваться в ядро мог только полипротеин вируса p6, но не вируса, содержащего вставки. Кроме того, ученые создали искусственные вставки с разными сигналами ядерной локализации из различных генов, но ни в одном случае не удалось добиться такой же высокой эффективности репликации, как у штамма p6. Следовательно, она обеспечивается другими генетическими детерминантами.
Ученые предположили, что на эффективность репликации могут влиять аминокислотные замены, которые есть в геноме штамма p6, но не p1. Они клонировали все 19 таких замен в штамм p1, чтобы оценить их влияние на эффективность репликации вируса гепатита Е. Оказалось, что точечная мутация A220T в домене метилтрансферазы вместе со вставкой RPS17 в гипервариабельном участке вместе имели синергический эффект и повышали эффективность репликации вируса до уровня штамма p6. Аналогичный эффект исследователи наблюдали, когда клонировали мутацию и вставку в другой штамм вируса гепатита Е — 83-2, в котором нет никаких вставок.
Таким образом, исследователи смогли определить генетические детерминанты, которые позволяют вирусу гепатита Е повышать эффективность репликации. В частности, он может «заимствовать» фрагменты РНК хозяина и вставлять их в свой гипервариабельный участок. Тем не менее, ни одна из геномных перестроек вируса не влияла на его чувствительность к рибавирину.
Источник
Wißing, M. H. et al. Genetic determinants of host- and virusderived insertions for hepatitis E virus replication. // Nature Communications (2024). DOI: 10.1038/s41467-024-49219-8