Ученые из международного консорциума BioRescue путем контролируемого культивирования плюрипотентных стволовых клеток, полученных ранее из фибробластов кожи северного белого носорога, создали первичные половые клетки. Следующий шаг команды BioRescue — превратить протогаметы в жизнеспособные яйцеклетки и сперматозоиды.
Изображение:
Фату и Наджин в заповеднике Ол Педжета (Кения).
Credit:
Jan Stejskal, Safari Park Dvůr Králové | Пресс-релиз
Северный белый носорог — подвид носорога, который считается исчезнувшим в дикой природе. Две последних особи этого подвида живут в заповеднике Ол Педжета в Кении, и обе они являются самками. Последний самец, Судан, умер в 2018 году. Северные белые носороги уже не способны к размножению естественным путем, но исследователи из консорциума BioRescue продолжают искать методы восстановления почти вымершей популяции животных.
Международный консорциум BioRescue под руководством Института исследований зоопарка и дикой природы им. Лейбница и при участии Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка в 2019 году получил целевое финансирование от Федерального министерства образования и научных исследований Германии и поддержку правительства Кении для сохранения находящего под угрозой полного исчезновения северного белого носорога. Если эксперименты по спасению этого подвида закончатся успехом, то разработанная репродуктивная технология может быть использована и для сохранения других исчезающих видов.
Ученые из BioRescue применяют две стратегии: получение жизнеспособных гамет из соматических клеток умерших северных белых носорогов и оплодотворение яйцеклеток двух последних самок сперматозоидами, собранными у четырех уже умерших самцов, которые затем будут вынашивать самки близкого подвида — южного белого носорога. Авторы исследования, опубликованного в журнале Science Advances, пошли по первому пути и успешно культивировали первичные зародышевые клетки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).
ИПСК в наивной стадии из фибробластов кожи белого носорога команда BioRescue получила ранее. Линии ИПСК были созданы из образца кожи, взятого у Набире, самки белого носорога, которая жила в чешском зоопарке и умерла в 2015 году.
Плюрипотентные стволовые клетки — мощный современный инструмент для биомедицинских исследований, но получение яйцеклеток или сперматозоидов из стволовых клеток является крайне сложной задачей. Модифицированные гаметы чаще всего оказываются менее жизнеспособными, чем клетки животного-хозяина, поэтому проигрывают им в конкуренции при оплодотворении. Соавтор проекта по получению первичных зародышевых клеток из ИПСК профессор Кацухико Хаяши с коллегами в 2016 году уже успешно реализовал этот процесс на мышах. Полученные первичные половые клетки мыши были полностью функциональными и развиваясь в фертильные яйцеклетки или сперматозоиды после трансплантации в яичники и тестикулы соответственно. Но перенос технологии на гораздо более крупный вид животных — серьезный вызов.
Гаметогенез in vitro начался с культивирования эмбриональных стволовых клеток, полученных от южных белых носорогов. Клетки обрабатывали смесью факторов для преиндукции, после чего переходили к стимулированию трансформации в клетки, подобные первичным половым клеткам, и постепенно подбирали необходимые для превращения условия. Ученые контролировали гены POU5F1/OCT3/4 и PRDM1/BLIMP1, так как их экспрессия характерна именно для первичных половых клеток. После этого авторы работали только с клетками, в которых после инкубирования экспрессировались эти гены. Кроме того, для полученных зародышевых клеток была характерна повышенная экспрессия генов, указывающих на принадлежность к первичным половым клеткам: SOX17, PRDM1 и NANOS3.
Авторы исследования размножили полученные при культивировании первичные предшественники гамет. При этом они приобрели способность к передвижению за счет образования нитевидных выпячиваний мембраны — филоподий.
Гаметогенез ИПСК, созданных из фибробластов кожи северного белого носорога, осуществлялся по отработанной на эмбриональных клетках южного подвида схеме. С помощью анализа транскриптома исследователи пришли к выводу, что дифференцировка клеток северного белого носорога в протозародышевые клетки протекает сходно с этим процессом у южного носорога.
Дифференцировка в первичные зародышевые клетки в первую очередь зависела своевременной активации BMP- и WNT-сигналинга. Генетический анализ показал, что фактор транскрипции, кодируемый геном SOX17, играет существенную роль в развитии зародышевых клеток человека и других видов млекопитающих и является ключевым для индукции трансформации ИПСК и получения первичных половых клеток носорога.
Авторы исследования обнаружили два специфических маркера — CD9 и ITGA6, которые экспрессировались на поверхности клеток-предшественников половых клеток белых носорогов. По мнению авторов, в дальнейшем именно эти маркеры помогут обнаруживать и изолировать первичные зародышевые клетки, появляющиеся среди ИПСК в процессе гаметогенеза.
Исследование представляет собой первый шаг к производству жизнеспособных гамет северного белого носорога и пониманию основных механизмов дифференцировки и спецификации первичных зародышевых клеток у крупных животных. Теперь команда консорциума BioRescue перешла к следующей сложной задаче: превращению первичных половых клеток в функциональные яйцеклетки и сперматозоиды. Первичные клетки относительно малы по сравнению со зрелыми гаметами и по-прежнему имеют двойной набор хромосом. Поэтому необходимо подобрать подходящие условия, при которых первичные половые клетки будут расти и делиться. Главная цель работы — адаптировать этот метод для широкого производства гамет исчезающих видов животных.
Источник:
Hayashi M., et al. Robust induction of primordial germ cells of white rhinoceros on the brink of extinction // Science Advances (2022), Vol 8, Issue 49, published online 09 Dec 2022. DOI: 10.1126/sciadv.abp9683