На второй день конференции «Молекулярная диагностика 2021» прошла секция, посвященная методам, которые применяются для point-of-care-диагностики инфекционных заболеваний, в том числе COVID-19. Специалисты обсудили микрофлюидные технологии, возможности мультиплексного анализа, методы детекции, настоящее и будущее диагностики в местах оказания медицинской помощи.
Credit:
dolgachov | 123rf.com
Открыл секцию Антон Букатин из Института аналитического приборостроения РАН с докладом «Микрофлюидные технологии в приборах point-of-care». Он объяснил, что point-of-care testing, или устройства для оказания медицинской помощи на месте, позволяют выполнять диагностику рядом с пациентом или даже в домашних условиях. Примером служат портативные глюкометры. Устройства должны работать с малыми объемами доступных образцов (слюна, пот, кровь из пальца).
Важную роль играет микрофлюидика. Микрофлюидные устройства используют малые объемы веществ и реагентов, могут детектировать одиночные клетки и молекулы, их работу можно автоматизировать.
Есть два ключевых элемента работы: чипы и устройства диагностики. Существуют разные материалы для изготовления микрочипов, зачастую они отличаются в зависимости от области применения. Например, для лабораторий делают кремниевую мастер-форму, затем отливают устройство из PDMS. Для коммерческого производства такая технология не подходит.
В чипах можно интегрировать различные функциональные элементы, такие как наноканалы, нанопоры и т.д. Докладчик привел пример использования таких устройств для моделирования микроциркуляции, а также для проведения ПЦР. При этом для детектирования флуоресценции можно использовать даже камеру мобильного телефона.
Дмитрий Басманов из Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины ФМБА России прочитал доклад на тему «Безмаркерный микрофлюидный биосенсор для мультиплексного анализа». Безмаркерный микрофлюидный биосенсор предвосхищает дальнейшие разработки в области микрофлюидики и создания приборов для диагностики.
Поверхностный плазмонный резонанс — метод детекции взаимодействия биомолекул или газовых сред с приповерхностным слоем. Чувствительным элементом зачастую является золотая пленка. Это плазмонный материал, который поддерживает распространение вдоль поверхности поверхностных плазмонов. При взаимодействии молекулы с поверхностью изменяется приповерхностный показатель преломления и условия возбуждения поверхностной волны, и молекулу можно детектировать.
Вместо среды, граничащей и с призмой, и с металлической пленкой, можно использовать фотонный кристалл. Тот же принцип используют, чтобы создать мультиплексные биосенсоры. А чувствительность увеличивают, модифицируя поверхность.
Разработчики надеются, что в будущем этот принцип можно будет использовать для типирования туберкулезной инфекции (определение ее резистентности).
Уже апробирована и входит в клиническую практику система для выявления SARS-CoV-2 на основе реакции изотермической амплификации — Изаскрин-8. Масса анализатора — 1 кг, работает от аккумулятора. Идет процесс регистрации, но система уже валидирована на нескольких площадках.
Далее Станислав Пауль из ООО «Троицкий инженерный центр» выступил с докладом «Некоторые проблемы создания решений для ПЦР-диагностике в формате point-of-care». Он рассказал о Центре и о продукции, которые он выпускает, например, «БиоЭксперт», компактный RT-PCR анализатор. Прибор компактный и может работать в поле от аккумулятора.
Уже существуют компактные приборы для ПЦР-диагностики SARS-CoV-2. Но ПЦР-диагностика в формате point-of-care сопряжена с определенными трудностями, например, выбор рынка сбыта и стоимости, метода изготовления не только прототипа, но и серийного продукта, пузыри в каналах и камерах, мертвые объемы в системе, выбор и реализация метода выделения РНК и ДНК, воспроизводимость результатов.
«Троицкий инженерный центр» разрабатывает анализатор SARS-CoV-2 совместно с ЦСП ФМБА. У него полностью автоматизирована пробоподготовка, анализ методом LAMP, три спектральных канала детекции и одноразовый картридж с лиофилизированными реагентами.
Далее Сергей Долгушин, директор ООО «Айвок», представил доклад «Современные решения для point-of-care-диагностики методом изотермической амплификации». Изотермическая амплификация позволяет ускорить анализ, приборы при этом упрощаются, а биохимия становится сложнее и дороже.
Point-of-care предполагают одну точку диагностики, одну пробу и один картридж с одним прибором. Прибору нужен только картридж. Докладчик привел в пример прибор LAMPIX8, который позволяет делать любые изотермические тесты. Он весит всего 250 грамм, работает с любыми изотермическими тест-системами, использующими красители FAM/SYBR, и обладает высокой чувствительностью.
При упрощении прибора усложняется картридж. Картридж должен работать без контакта жидкости с прибором. Это достигается хранением реагентов и буферов в самом картридже. Часто пользователи таких приборов — неспециалисты. То есть важны простота и удобство использования картриджа, а также цена. Докладчик предлагает использовать одноразовые блистеры, предзаполненные реагентами.
Завершил секцию Владимир Кукушкин из Института физики твердого тела с докладом «Оценка возможностей создания быстрых иммунологических биосенсоров для специфической индикации патогенных биологических агентов методом рамановской спектроскопии». Он говорил об разработке оптических биосенсоров для выявления патогенов. Сенсоры работают на эффекте поверхностного усиленного рамановского рассеяния; в качестве узнающих элементов используются аптамеры.
Рамановская спектроскопия — это метод оптической спектроскопии, основанный на взаимодействии лазерного излучения с веществом. Спектроскопия дает спектральную характеристику колебаний молекул («молекулярный отпечаток») и применяется для идентификации веществ.
Можно изучать большое количество чистого молекулярного вещества, малое количество чистого молекулярного вещества и малое количество молекулярного вещества в смеси. Пример последнего — SERS-биосенсоры на основе узнающих элементов (например, аптамеров) для специфичной индикации патогенных биологических агентов в многокомпонентной смеси.
Докладчик представил схемы твердотельного SERS-аптасенсора для детектирования вируса гриппа и коллоидного SERS-аптасенсора для детектирования SARS-CoV-2.
Преимущества поверхностно-усиленной SERS-спектроскопии: высокая чувствительность, простота анализа и минимальная пробоподготовка. Аптамеры в этом случае лучше антител, потому что их легче синтезировать, очищать и модифицировать. Также они имеют небольшой размер, что важно для спектроскопии SERS, так как удаление от поверхности сильно уменьшает сигнал.
Информация о выступающих
Букатин Антон Сергеевич, к.ф.-м.н. ИАП РАН, Санкт-Петербург, СПбАУ им. Ж.И. Алферова, Санкт-Петербург
Басманов Дмитрий Викторович, и. о. рук. центра технологий и микрофабрикации ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России, Москва
Пауль Станислав Юрьевич, инженер-исследователь ООО «Троицкий инженерный центр», Москва, г. Троицк
Долгушин Сергей Анатольевич, к.ф.-м.н., директор ООО «Айвок», Москва, г. Зеленоград
Кукушкин Владимир Игоревич, к.ф.-м.н. ИФТТ РАН, Черноголовка
